[發明專利]一種O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201310017378.8
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103076451A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 馬軍武;馮霞;周廣青;楊亞民
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

1.一種O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒，其特征在于，主要包括以下組分：

⑴?酶標板（5塊，規格96孔，未包被）；

⑵?O型口蹄疫標準對照抗原（5管，5?ml/管，濃度1.48μg/ml）；

⑶?破乳劑（2ml）；

⑷?口蹄疫O型兔抗血清（1管，70μl/管，工作濃度（1:1000））；

⑸?口蹄疫O型豚鼠抗血清（1管，70μl/管，工作濃度（1:1000））；

⑹?兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物（1管，120μl/管，工作濃度（1:500）；

⑺?豚鼠抗血清稀釋液；

⑻?25倍PBST濃縮液（25×PBST，3瓶，60?ml/瓶）；

⑼?碳酸鹽緩沖液膠囊；

⑽?檸檬酸-磷酸鹽緩沖液片劑；

⑾?OPD片劑；

⑿?終止液（1瓶，60ml/瓶）；

⒀?封板膜；

⒁?移液槽；

⒂?96孔U型稀釋板。

2.權利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下A-F的步驟：

A?、O型口蹄疫標準對照抗原的儲備；

B、O型口蹄疫標準對照抗原146S的純化：

利用蔗糖密度梯度法（45%、35%、25%、15%），獲得146S抗原1.48μg/ml；

C、O型口蹄疫間接夾心ELISA方法的建立：

（1）包被ELISA板：用碳酸鹽包被緩沖液稀釋口蹄疫O型兔抗血清至工作濃度(1:1000)，混勻，每孔加50μl于底部，盡量不觸及孔壁，輕輕震蕩2-3分鐘，使液體鋪滿孔底；用封板膜封板或置濕盒中室溫過夜；

（2）洗滌ELISA板：小心揭掉封板膜，棄去液體，每孔加滿洗滌液（1×PBST，磷酸鹽吐溫緩沖液），靜置30秒后棄去，如此重復4次，拍干；

（3）加樣：用1×PBST將對照抗原和被檢抗原（均平行加2列）從1:2（50μl抗原加50μl?PBST）開始做2倍連續稀釋至1:256；每孔加50μl，37℃，溫育1小時；用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

（4）加二抗：用豚鼠抗血清稀釋液稀釋（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）口蹄疫O型豚鼠抗血清至工作濃度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃，溫育1小時；用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

（5）加酶：用1×PBST稀釋兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物至工作濃度（1:500），每孔加50μl，37℃溫育1小時；用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；

（6）顯色：每孔加50μl底物溶液（20mmol/L?OPD，0.05M檸檬酸磷酸鹽緩沖液，0.015%H2O2）），37℃溫育15分鐘；

（7）終止：每孔再加50?μl?終止液（1.25%?H₂SO₄）終止反應；

（8）測定：在490nm?波長下讀取光吸收值（OD490nm）；

D、標準對照抗原標準曲線的繪制：

以標準對照抗原的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線；

E、被檢測抗原有效抗原含量的測定：

根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度；

F、敏感性和特異性的測定：

方法步驟E相同，將146S抗原作系列稀釋，用標準對照抗原的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式的最小抗原含量；

特異性檢測，將其它型的口蹄疫抗原作為被檢抗原時，反應OD值小于標準對照抗原的敏感性檢測值。

3.權利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在口蹄疫抗原的含量測定和抗原分型中的應用。

4.權利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在O型口蹄疫抗疫苗效力評估中的應用。