[發明專利]一種古菌嗜熱酯酶及(S)-酮洛芬的制備方法

無效

• 申請號: 201310016202.0
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103194467A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 魏濤;張飛;馮昕;孫浩;姜春鵬
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/16;C12P7/40
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發明設計一種古菌嗜熱酯酶及其用于制備(S)-酮洛芬的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

2-芳基丙酸類藥物（2-APA）屬于非甾體消炎鎮痛藥（NSAIDS），是解熱鎮痛、消炎抗風濕的基本藥物和主要產品，它是目前處方藥和非處方藥處方量最大的一類藥物。常用的有布洛芬、奈普生和酮洛芬?3?種，其?α位有一個手性碳原子存在(S)-構型和(R)-構型一對光學對映體，臨床上一般以外消旋體的形式供應。其中酮洛芬的消炎鎮痛作用是阿司匹林的150倍，解熱作用是阿司匹林的?100?倍，臨床上用于治療慢性類風濕性關節炎、變性性關節炎、外傷和術后疼痛等。藥理實驗表明，其(S)-異構體的消炎鎮痛作用是外消旋酮洛芬的2倍，而(R)-異構體的活性很低，但有其他方面藥用價值，它對牙周病的骨質疏松有治療作用。

目前，(S)-?酮洛芬的制備方法主要有化學合成法和微生物酶法拆分。采用化學法合成(S)-?酮洛芬，一般先得到等量的一對對映體混合物(外消旋體),將其拆分是獲得光學純(S)-?酮洛芬。通常利用手性試劑將外消旋體混合物中一對對映體轉化為兩種非對映體,然后利用非對映體理化性質的差異,將其分開,但此拆分過程較繁雜,手性試劑昂貴,多數情況下難以得到滿意的收率。采用微生物酶法拆分合成(S)-?酮洛芬，具有立體專一性強、拆分效率高、生產條件溫和、無環境污染、反應步驟簡單、不需手性源、生產成本低等諸多優點。目前，用于拆分(S)-?酮洛芬的酶多數是商品化的脂肪酶，而利用酯酶拆分合成(S)-?酮洛芬的方法還未建立。商品化的脂肪酶多數是在中溫酶，反應pH也在中性左右，沒有能夠適應高溫酸性條件下拆分合成(S)-?酮洛芬的脂肪酶。

發明內容

本發明要解決的技術問題是化學合成法制備（S）-酮洛芬收率低。提供一種古菌嗜熱酯酶及其用于制備（S）-酮洛芬的方法。

本發明的技術方案是：一種古菌嗜熱酯酶的制備方法，包括菌株、質粒、酶與培養基，PCR擴增及重組質粒的構建，基因的誘導表達與蛋白質的純化，它的步驟如下：

（1）設計一對引物:?上游[5’-GCC?CATATG?GTT?AAG?CTG?ATA?ATC?AAG-3’]，下游[5’-GAT?GTCGAC?TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC-3’]，以Thermotoga?maritima全基因組序列為模板進行擴增，用內切酶酶切后連接到經同樣內切酶酶切的pET15b上，連接產物轉化大腸桿菌E.coli?DH5α，篩選重組質粒，進行雙酶切及測序驗證；

（2）基因的誘導表達與蛋白質的純化：將重組質粒轉化E.?coli?BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5?mol/L?IPTG于37℃繼續培養4?h，誘導表達的蛋白經過70℃熱處理30?min，鎳柱親和層析(洗脫緩沖液：20?mM?Tris-HCl,?pH?8.0,?500?mM?NaCl,?300?mM?imidazole)?和分子篩Superdex-200?(16/60)?column（洗脫緩沖液：50?mM?Tris-HCl,?pH?8.0,?200?mM?NaCl；洗脫速度為：0.5?ml/min）純化后，得到古菌嗜熱酯酶。

所述的古菌嗜熱酯酶用于制備(S)-酮洛芬的方法，它的步驟如下：反應體系中底物酮洛芬乙酸酯?25?mg/ml，古菌嗜熱酯酶0.235?mg/ml，1?ml?50?mM醋酸鈉緩沖液，反應體系的pH為5-6，在反應溫度60-80?℃，200-250?rpm/min攪拌速度條件下下，水解反應10-60?h，得到(S)-酮洛芬。

該酶的最適酶活溫度為70℃，最適酶活pH為5.0-5.5。該酶具有具有較好的嗜熱性和耐酸性，是目前已發現少數古菌嗜熱酯酶之一。

本發明的有益效果是：本發明得到了嗜熱酯酶的基因序列和氨基酸序列，該酶是在Thermotoga?maritima中發現并制備獲得的第一個古菌嗜熱酯酶；本發明獲得了一種不同于現有技術的新的古菌嗜熱酯酶；本發明獲得了一種在高溫酸性條件下酶法催化制備（S）-酮洛芬的新方法。