[發明專利]一種棗樹試管苗誘變多倍體篩選的新方法

有效

• 申請號: 201310003965.1
• 申請日: 2013-01-06
• 公開（公告）號: CN103004607A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 齊向英;張向前;陳宗禮;陳國梁;薛皓;高朋濤
• 申請（專利權）人: 延安大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種棗樹試管苗誘變多倍體篩選的新方法，屬于植物生物技術與植物遺傳育種領域或者植物試管誘變育種領域。

背景技術

我國是棗樹發源地，黃河峽谷流域是棗樹的發源地和優生區之一。陜北地區棗樹種植資源豐富。木棗為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus?jujube?Mill?Muzao)植物，《中國果樹志·棗卷》記載其果實中等大，圓柱形，側面略扁，平均果重14.1?g，果肉厚，綠白色，質地硬，稍粗，汁液較少，昧甜，略具酸味。含可溶性固形物28％~33％，總糖21.7％，酸0.79％，維生素C??461.7mg／l00?g，含水68％，可食率96.8％，適宜制干，品質中上等，制干率48.6％。木棗適應性強，耐旱澇、抗霜凍，山地、平原均可栽種。樹勢較強，發枝力中等，枝葉密度容易控制。根蘗萌生力弱，生長勢強，根系較發達，是理想的退耕還林樹種。

植物多倍體誘導后的篩選方法很多，主要有外部形態比較：果樹多倍體一般莖變短、葉變厚，葉形指數變小；顏色變深，表面皺縮粗糙、生長緩慢；花、果變大，可育性低。氣孔鑒定：多倍體的氣孔較二倍體大，葉片單位面積上的氣孔數量相對減少。這是一種較為可靠的鑒定方法。花粉粒鑒定：與二倍體相比，多倍體花粉粒體積大，生活力低。梢端組織發生層細胞鑒定：用切片染色法比較組織發生層的三層細胞和細胞核的大小，多倍體的比二倍體的大。染色體記數（直接鑒定法）：用植物的根尖細胞、莖尖細胞或花粉母細胞制片，在顯微鏡下直接觀察染色體數目變化。分子水平鑒定：采用流式細胞儀來測定單個細胞的DNA含量，再根據DNA含量比較來推斷出細胞的倍性。寧強（2008）是通過形態學和細胞學經過比較來確定大田條件下棗樹苗多倍體的。蔣洪恩（2004）采用Partec?DPAC軟件對倍性分析儀測定的DNA含量分布曲線分析，并對確定的四倍體做了氣孔數量、葉綠體數量、花粉等研究，在他們的研究中發現了大量的嵌合體。王?娜（2005）用組培苗的叢生芽通過秋水仙堿誘變處理獲得了變異植株，并結果3~4代的繼代培養純化了嵌合體。嚴仁玲（1995）經過秋水仙堿處理并對細胞學和氣孔做了研究，經過5代的繼代培養獲得了8個穩定的多倍體系。齊向英（2011）通過染色體變異確定了京棗的同源四倍體，并對其做了氣孔分析。

目前報道的均為先進行細胞染色體分析，然后再觀察形態學、解破學、孢粉學變化，主要存在以下幾個問題：①誘變率多指發生染色體數目變化的數量，后續報道較少；②嵌合體數量較多，純化培養時間長；③純化得到的四倍體突變體少。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種棗樹試管苗誘變多倍體篩選的新方法，旨在解決①誘變率多指發生染色體數目變化的數量，后續報道較少；②嵌合體數量較多，純化培養時間長；③純化得到的四倍體突變體少的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種棗樹試管苗誘變多倍體篩選的新方法，包括以下步驟：

①木棗試管苗誘變的基本程序；②根據形態學特征對誘變后的植株進行第一次篩選；③分化培養對分化出的叢生芽進行第二次篩選；④對篩選的目標叢生芽進行染色體分析；⑤對確定的多倍體進行培養。

進一步，具體包括以下步驟：

⑴?在木棗試管苗繼代培養基中加入秋水仙堿溶液，滅菌冷卻后，在超凈工作臺上將帶莖尖棗樹試管苗接種在培養基上，每瓶培養基可以接種5~7株試管苗；在光照1?500?lx±200?lx，每天給12?h的光照、濕度70%±5%、溫度25±1℃條件下培養30d，完成誘變過程；

⑵?將第一步中的誘變過程完成的棗樹試管苗按每瓶一個芽體的方式轉接到不含秋水仙堿的新培養基中；

⑶?將低溫培養結束后的棗樹試管苗接種在以MS為基本培養基，pH?=6.0、附加瓊脂55g/L、蔗糖30g/L、6-A1.0mg/L、IBA0.2?mg/L、TDZ0.01?mg/L的培養基上進行連續分化培養；

⑷?將第三步獲得的叢生芽按葉片形態是否變皺褶、莖干是否變粗壯、葉間距是否變短對其進行篩選。篩選后的植株再按單芽體進行培養；

⑸?對經過再次培養的疑是多倍體進行染色體壓片觀察，確認其是否是多倍體。

進一步，在木棗試管苗繼代培養基中加入30%的秋水仙堿溶液。