[發明專利]一種單細胞甲醇蛋白的工業化生產方法

有效

• 申請號: 201310001734.7
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103060212A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 喬國厚;王蘭甫;茍萬曉;胡元森;張寅;曹敏;樊崇;張國杰;許宗浩;衛紅偉;田亞鵬;朱廣有;王霞
• 申請（專利權）人: 義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 宋金鼎

1.一種單細胞甲醇蛋白的工業化生產方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）、分類命名為巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012342；

將甘油管保藏的巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株0.5mL接種至YPD試管斜面培養基上，30℃培養48小時，即得斜面種子，所述的YPD試管斜面培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂和余量的水混合在一起組成；用無菌水將斜面種子全部沖洗下來，以YPD液體培養基體積1%～5%的接種量接入到YPD液體培養基的中，搖床振蕩培養，培養溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養24～30小時，菌體OD₆₀₀達到3～5，獲得搖瓶種子，所述的YPD液體培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成；

2）、一級種子培養：

A、一級種子培養在50L的發酵罐中進行，步驟如下：按步驟1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液體培養基，打開蒸汽閥，使蒸汽進發酵罐夾套層，對YPD液體培養基進行滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時間30min，對YPD液體培養基滅菌的同時，對空氣過濾器和取樣口進行滅菌，滅菌10min即可，滅菌結束后，打開進氣閥，向發酵罐中通入無菌空氣，使罐體內空氣壓力一直要高于罐體外大氣壓，打開冷卻水閥門，使冷卻水進發酵罐夾套層，對YPD液體培養基進行降溫，當YPD液體培養基溫度降至25-35℃時，開始接種；

B、搖瓶種子1000mL從50L發酵罐接種口倒入，隨后控制發酵溫度在28～30℃，轉速150rpm，溶氧40%～50%，培養20～24h后，得一級種子；

3）、二級種子培養：

二級種子培養在5m³發酵罐中進行，二級種子培養基采用BSM液體培養基，步驟如下：5m³發酵罐中裝BSM液體培養基體積為3m³；所述的BSM液體培養基為：質量濃度85%磷酸15L/m³，二水硫酸鈣0.4Kg/m³，硫酸鉀8Kg/m³，七水硫酸鎂6Kg/m³，甘油36Kg/m³和微量元素溶液3L/m³加水制成，也就是說BSM液體培養基為質量濃度85%磷酸15L，二水硫酸鈣0.4Kg，硫酸鉀8Kg，七水硫酸鎂6Kg，甘油36Kg和微量元素溶液3L加水至1m³；所述的微量元素溶液為：五水硫酸銅14g/L，碘化鉀0.08g/L，一水硫酸錳4g/L，二水鉬酸鈉0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化鈷1g/L，氯化鋅36g/L、七水合硫酸亞鐵65g/L和質量濃度為98%的濃硫酸5mL/L加水制成，也就是說微量元素溶液為五水硫酸銅14g，碘化鉀0.08g，一水硫酸錳4g，二水鉬酸鈉0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化鈷1g，氯化鋅36g、七水合硫酸亞鐵65g和質量濃度為98%的濃硫酸5mL加水至1L；

用2）A步驟中對YPD液體培養基相同的滅菌方法對BSM液體培養基進行滅菌，滅菌完成后，用質量濃度為35%的氨水調BSM液體培養基pH值至4.8～5.0，然后將培養好的一級種子30L接種到3m³的BSM液體培養基中，接種量為1%，接種時二級種子罐罐壓在0.01-0.03MPa，一級種子罐罐壓在0.05-0.1MPa，通過空氣壓力將一級種子從一級種子罐壓到二級種子罐中，接種完成后，保持二級種子罐溫度30～32℃，通風比1：1~1.5vvm，罐壓0.05MPa，pH5.0～5.5，培養24~30h，得二級種子；

4）、發酵罐甲醇蛋白生產

發酵培養基為與3）步驟中的二級種子的BSM液體培養基相同的培養基，開啟進料泵，調節進料閥門大小，以控制發酵培養基的進料速度為3～4m³/h，同時打開蒸汽閥門，將蒸汽與發酵培養基混合，使發酵培養基溫度達到121-125℃，進入在層流罐中維持20min后，進入50m³發酵罐中，進料完畢后，關閉進料閥，并將50m³發酵罐溫度維持在121℃30min，此時，用蒸汽對與50m³發酵罐相連的空氣過濾器、發酵罐取樣口、出料口、排氣口管道進行滅菌，保證50m³發酵罐及與之相連管道呈無菌狀態，滅菌結束后，對50m³發酵罐內的發酵培養基降溫到30℃～35℃；用質量濃度為35%的氨水調發酵培養基至pH5.0，然后將二級種子以發酵培養基體積10%的接種量接種到50m³發酵罐內pH值為5.0的發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30～32℃，通風比1：1.5~2?vvm，罐壓0.04MPa，pH5.0～5.5，培養16~20h，罐內料液中的甘油消耗完，溶氧開始持續上升，罐內菌體OD₆₀₀達到36～40，濕重達到100～120g/L，向50m³發酵罐內流加甲醇，甲醇流加量為5～6克/升·小時，當溶氧高于60%以上時，加大甲醇流加量，最大流加量達到10～15克/升·小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至發酵結束，發酵72～84小時后，取樣測定菌體濕重達350～400g/L，發酵結束，得發酵液；

5）、出料

發酵結束后，利用罐壓將發酵液從出料管道導入到發酵液儲罐中，靜置，沉降4～8小時，沉降液經臥螺離心機離心，得菌泥，收集到儲存罐中，加入菌泥體積1/5的清水，攪拌均勻，進入噴霧干燥機，噴霧干燥，收集蛋白干粉。

2.根據權利要求1所述的單細胞甲醇蛋白的工業化生產方法，其特征在于，包括如下步驟：1）、搖瓶種子培養：

將甘油管保藏的巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株0.5mL用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，30℃培養48小時，即得斜面種子；取1支培養好的斜面種子，用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有250mL?YPD液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養24小時后，菌體OD₆₀₀達到3～5，獲得搖瓶種子；

2）、一級種子培養：

A、在50L發酵罐中先加水10L，再投入300克酵母提取物、600克胰蛋白胨、600克葡萄糖，攪拌溶解，然后再加水至30L得YPD液體培養基，打開罐體蒸汽閥進口，通蒸汽進發酵罐夾套層，將YPD液體培養基進行滅菌，滅菌溫度121℃，時間30min，同時，對發酵罐的空氣過濾器和取樣口滅菌10min，滅菌結束后，打開進氣閥，向發酵罐中通入無菌空氣，使罐體內空氣壓力一直要高于罐體外大氣壓，同時使冷卻水進入罐體夾套對培養基降溫，當培養基溫度降至30℃時，開始接種；

B、搖瓶種子1000mL從50L發酵罐接種口倒入，接種前檢查種子質量，要求無雜菌污染，菌體生長良好，出芽整齊，接種后，控制發酵罐溫度30℃，轉速150rpm，溶氧40%～50%，培養24h后，得一級種子；

3）、二級種子培養：

將3m³BSM液體培養基裝入5m³發酵罐中，用2）A步驟中對YPD液體培養基相同的滅菌方法對BSM液體培養基進行滅菌，滅菌完成后，用質量濃度為35%的氨水調BSM液體培養基pH值至4.8～5.0，然后將30L一級種子通過壓力管道接種到5m³發酵罐內pH值為4.8～5.0的BSM液體培養基中，接種時二級種子罐罐壓在0.01-0.03MPa，一級種子罐罐壓在0.05-0.1MPa，通過空氣壓力將一級種子從一級種子罐壓到二級種子罐中，接種完成后，保持二級種子罐溫度32℃，通風比1：1~1.5vvm，罐壓0.05MPa，pH5.0～5.5，培養30h，得二級種子；

4）、50m³發酵罐中甲醇蛋白的發酵生產

發酵培養基為與3）步驟中的二級種子所用BSM液體培養基相同配方，首先將30m³發酵培養基投入到配料罐內，開啟進料泵，調節進料閥門大小，以控制發酵培養基的進料速度為4m³/h，同時打開蒸汽閥門，將蒸汽與發酵培養基混合，使發酵培養基溫度達到125℃，進入層流罐中維持20min后，進入50m³發酵罐中，當進料完畢后，關閉進料閥，并將50m³發酵罐溫度維持在121℃30min，此時，用蒸汽對與50m³發酵罐相連的空氣過濾器、發酵罐取樣口、出料口、排氣口管道進行滅菌，保證50m³發酵罐及與之相連管道呈無菌狀態，滅菌結束后，打開50m³發酵罐內盤管冷卻管進水閥門，對發酵培養基降溫；待發酵培養基溫度降到30℃時，用質量濃度為35%的氨水調發酵培養基至pH5.0，然后將3m³二級種子接種到50m³發酵罐內的pH值為5.0的30m³發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30℃，通風比1：1.5~2?vvm，罐壓0.04MPa，pH5.0～5.5，培養20h，罐內料液中的甘油消耗完，溶氧開始持續上升，罐內菌體OD₆₀₀達到40，濕重達到120g/L，向50m³發酵罐內流加甲醇，甲醇流加量為5～6克/升·小時，當溶氧上升高于60%以上時，加大甲醇流加量，最大流加量達到10～15克/升·小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至發酵結束，發酵72小時后，取樣測定菌體濕重達392g/L，發酵結束，得發酵液；

5）、出料

發酵結束后，利用罐壓將發酵液從出料管道導入到兩個25m³的發酵液儲罐中，靜置沉降4～8小時，沉降液經臥螺離心機離心，離心機轉速3000轉/分鐘，進料量5噸/小時，離心獲得菌泥，收集到發酵液儲存罐中，向發酵液儲存罐中加入2m³清水，攪拌均勻，進入噴霧干燥機，調節進口溫度至130～150℃、出口溫度至65-80℃，進料流量為1噸/小時，進行噴霧干燥，收集蛋白干粉。