[發明專利]用于標記白細胞的細胞內靶標和細胞外靶標的方法

有效

• 申請號: 201280063544.1
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN104011542A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 法布里斯·馬萊格;安德烈亞斯·范艾多芬
• 申請（專利權）人: 貝克曼考爾特公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/569
• 代理公司: 上海市華誠律師事務所 31210
• 代理人: 湯國華

1.一種用于標記白細胞的細胞內靶標和細胞外靶標的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)形成以下物質的組合：

(i)細胞組合物，所述細胞組合物包含至少白細胞和血紅細胞，以及

(ii)第一溶液，所述第一溶液包含能夠交聯所述白細胞的細胞內蛋白、脂蛋白和核酸的一種或多種試劑；

(b)將第二溶液添加到所述組合中，所述第二溶液包含能夠透化所述白細胞、裂解所述血紅細胞并中和所述第一溶液中的所述一種或多種試劑的交聯活性的一種或多種試劑，

其中所述第二溶液包含：

(i)量為0.05％至0.5％(w/v)的洗滌劑，和

(ii)濃度為1至100mM的季銨鹽或含胺的化合物，

其中所述第二溶液的pH為6.5或更低，并且

其中所述第二溶液的添加體積介于所述組合的總體積的1倍和10倍之間；

(c)在添加所述第二溶液的同時或在添加所述第二溶液之后添加特異性地結合到白細胞的細胞外靶標上的至少一種結合劑，以及特異性地結合到白細胞的細胞內靶標上的至少一種結合劑，

其中所述結合劑的每一種包括可檢測試劑；以及

(d)將第三溶液添加到所述組合中，其中所述第三溶液的添加體積等于或大于所述第三溶液添加到其中的所述組合的總體積。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞組合物選自全血、骨髓和腹膜液。

3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中在步驟(b)之前，將在步驟(a)中獲得的所述組合溫育5至20分鐘。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中在步驟(d)之前，將在步驟(c)中獲得的所述組合溫育15至60分鐘。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中在添加所述第一溶液之后，步驟(a)的所述一種或多種試劑以0.5％至2％(v/v)的量包含在所述組合中。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中步驟(a)的一種或多種試劑選自甲醛、低聚甲醛和戊二醛。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述第二溶液包含：

(i)含量適于實現將所述細胞組合物中所包含的基本上所有的血紅細胞裂解，而所述細胞組合物中所包含的大多數白細胞不被裂解的洗滌劑，以及

(ii)用于中和步驟(a)的所述一種或多種試劑的中和劑。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中在步驟(b)中，所述第二溶液的添加體積介于所述組合的總體積的4倍和8倍之間。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中在步驟(d)之前不執行離心步驟。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中在步驟(b)之后或步驟(c)之后不執行離心步驟。

11.一種用于執行根據權利要求1至10中任一項所述的方法的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)第一溶液，所述第一溶液包含選自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的化合物；

(b)第二溶液，所述第二溶液包含：

(i)季銨鹽或含胺的化合物，和

(ii)洗滌劑；以及

(c)第三溶液，所述第三溶液包含：

(i)選自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的化合物，和

(ii)洗滌劑。

12.根據權利要求11所述的試劑盒，其中

(a)所述第一溶液包含濃度介于5％和15％(v/v)之間的甲醛；

(b)所述第二溶液包含：

(i)濃度為1至100mM的氯化銨(NH₄Cl)，和

(ii)濃度為0.05％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸鈉；以及

(c)所述第三溶液包含：

(i)濃度介于0.01％和1％(v/v)之間的甲醛，和

(ii)濃度為0.01％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸鈉。

13.根據權利要求11或權利要求12所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括：

(a)包含可通過流式細胞術檢測的標記的至少一種結合劑，其中所述結合劑特異性地結合到白細胞的細胞外靶標上；以及

(b)包含可通過流式細胞術檢測的標記的至少一種結合劑，其中所述結合劑特異性地結合到白細胞的細胞內靶標上；

其中所述細胞外結合劑和所述細胞內結合劑在單獨的管中提供，或作為所述第二溶液的組分提供。