[發明專利]用于合成脂肪酸的細菌和方法

無效

• 申請號: 201280062238.6
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN103998616A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: K-Y·桑;M·利
• 申請（專利權）人: 威廉馬什萊斯大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N9/16
• 代理公司: 北京嘉和天工知識產權代理事務所(普通合伙) 11269
• 代理人: 甘玲

在先相關申請

本申請要求2011年10月17日提交的61/548,005和2011年10月18日提交的61/548,399的優先權，各自通過引用以整體并入。

聯邦資助的研究聲明

本發明根據由國家科學基金會授予的撥款號：EEC-0813570在政府支持下進行。政府享有本發明的某些權利。

技術領域

本發明涉及通過使用基因工程微生物增加脂肪酸的生產的方法。

背景技術

日益增加的能源成本和環境問題都已強調對于生產可持續的、可再生的燃料和化學品的需求。脂肪酸由長的烷基鏈組成并且代表自然界的“石油”，作為被細胞使用的初級代謝產物用于化學和能量存儲功能。這些高能分子現今從植物和動物油分離，用于從燃料到油脂化學品的多樣化的產品。

鑒于用于生產乙醇和相關醇生物燃料的微生物發酵工藝已經非常成熟，生物柴油(脂肪酸的甲基酯)為生物學生產的主要的長鏈產物，并且現今它幾乎全部來源于植物油。然而，工程油籽代謝的緩慢的循環時間和作為副產品的甘油的過度累積為從植物獲得生物柴油的兩個主要缺點。盡管大多數細菌產生脂肪酸作為細胞被膜前體，但是脂肪酸的生物合成在多個層次被嚴密地調節并且并不生產較大的量。因此，從細菌生產脂肪酸還沒有達到符合成本效益的地步。

通過代謝工程菌株以高產量和高速率生產游離脂肪酸的能力將提供生物學或化學生產較大類的其它衍生產物(化學品和生物燃料)的有效框架。例如，如圖1中所示，通過引入額外的適當途徑，脂肪酸可被轉化為化學品比如烴類、脂肪醇、羥基脂肪酸、二羧酸等。同樣地，分子的ω端可在脂肪酸生物合成途徑的初始步驟中通過改變起始前體而被修飾(由白色塊箭頭標記)。此外，這些分子的鏈長度可通過使用對特定鏈長度比如C8、C10、C12或C14特異的適當的酰基-ACP硫酯酶而改變。另外，也可在脂肪酸延伸循環期間的不同時間點挖掘出各種分子。

US7759094公開了用于通過基因工程微生物的發酵生產L-氨基酸的方法，其中fadR被過表達并且sucC也被過表達。然而，在該專利中沒有關于脂肪酸生產的教導。

US7553645公開了用于使用基因工程或轉化的微生物制備L-氨基酸的工藝，其中sucC被過表達。然而，在該專利中沒有關于脂肪酸生產的教導。

US7211415也公開了用于通過腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的基因工程微生物的發酵生產L-氨基酸的工藝，其中sucC被過表達。然而，在該專利中沒有關于脂肪酸生產的教導。

US20110195505公開了用于丁醇生產的基因工程乳酸菌，其中在fabZl的缺失導致整個細胞膜飽和脂肪酸的10％的增加。然而，沒有關于fabZ過表達對脂肪酸生產的影響的教導。

US20080160585和US20080038787公開了增加從微生物生產賴氨酸的方法，其中sucC調節失控(deregulated)。然而，對于所涉及的調節失控的程度，比如過表達、減少或失活沒有公開細節，也沒有關于如何達到所述調節失控。

US20060046288公開了具有增加的琥珀酸生產的突變的大腸桿菌(E.coli)菌株，其中fadR基因活性降低。然而，沒有具體公開關于所述fadR基因或其調節/突變的細節。

WO2011116279公開了雜合的ACP硫酯酶，其可與天然的fadD和sucC缺失組合。它們還教導了使培養基酸化以增加脂肪酸的生產。

因此，在本領域中存在對于比迄今所能實現的更有效且更具成本效益的生產脂肪酸的生物系統的需要。

發明內容

本發明涉及通過基因工程微生物生產脂肪酸，特別涉及借助于例如植物酰基-ACP硫酯酶的加入和參與脂肪酸生物合成和/或降解途徑的轉錄因子；這些轉錄因子與在脂肪酸合成途徑、脂肪酸降解途徑或中心代謝途徑中挑選的基因的一種或更多種的組合的操縱生產大量的游離脂肪酸的工程微生物。

本發明將允許生產具有與最高理論產量接近的產量的游離脂肪酸。同樣地，本發明將提供經濟地生產共享脂肪酸合成途徑或從脂肪酸合成途徑分支的許多其它產物的必要框架。這些產物包括烴類、脂肪醇、羥基脂肪酸、二羧酸等。

更詳細地，本發明為以下的一種或更多種：

一種用于生產脂肪酸的基因工程細菌，所述細菌包含含有以下的基因型：

i)過表達的酰基ACP硫酯酶(TE⁺)；