[發明專利]用于合成可拉酸、甘露糖基化和/或巖藻糖基化寡糖的突變微生物

有效

• 申請號: 201280061882.1
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103987841A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 約里·博普雷;加斯帕德·勒丘;喬·梅爾滕斯
• 申請（專利權）人: 根特大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12P19/44;C12P19/00;C12P7/40;C12P17/06;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬

技術領域

本發明涉及用于合成多種化合物的突變和/或轉化的微生物。更特別地，本發明公開了在編碼調節因子ArcA和IclR的基因中突變的微生物。后者所述造成作為可拉酸(colanic?acid)操縱子一部分之基因的顯著上調。因此，所述微生物可用于合成作為可拉酸途徑一部分的任何化合物(例如GDP-巖藻糖、GDP-甘露糖和可拉酸)，和/或還可用于(從作為前體的GDP-巖藻糖開始)合成巖藻糖基化的寡糖或用于(從作為前體的GDP-甘露糖開始)合成甘露糖基化的寡糖。此外，在編碼轉錄調節因子ArcA和IclR之基因中的突變導致允許在合成pH敏感分子或有機酸的指數生長期中的酸抗性表型。

背景技術

已知編碼需氧呼吸調控蛋白(aerobic?respiration?control?protein)的基因arcA和編碼異檸檬酸裂合酶調節因子(isocitratelyase?regulator)的基因iclR調節中心碳代謝(central?carbon?metabolism)。ArcA是調節很多種基因的全局轉錄調節因子(global?transcriptional?regulator)，而IclR為調節乙醛酸途徑(glyoxylate?pathway)的局部轉錄調節因子。已知ArcA調節響應于缺氧的中心碳代謝(central?carbon?metabolism)，并且除了其也調節乙醛酸途徑之外與IclR無聯系(24、28、29、37、38)。在之前的研究中，已經觀察到ΔiclRΔarcA突變菌株對中心碳代謝的組合作用。在三羧酸(tricarboxylic?acid，TCA)循環和乙醛酸途徑中顯示出提高的通量，且當這兩個基因被敲除時出現了令人感興趣和出人意料的表型，即雙突變菌株以接近最大理論產率的產率形成生物質(4、39)。

對一些化合物(例如GDP-巖藻糖)有很高的需要。后一種化合物實際上是巖藻糖基化寡糖(例如巖藻糖基乳糖、巖藻糖基乳糖N二糖(fucosyllactoNbiose)和Lewis?X寡糖)或巖藻糖基化蛋白的前體。這些糖是人母乳的組分，其中它們具有抗炎及益生作用(prebiotic?effect)和/或作為營養品、抗炎劑或益生素在治療中有應用，此外，巖藻糖基化蛋白可用于制藥(5、8、27)。然而，仍需要產生后一種高價值化合物的高效方法。

此外，GDP-甘露糖也是針對GDP-巖藻糖之途徑的中間體。過早地中斷該途徑導致該化合物的積累，其為甘露糖基化寡糖的前體。這些寡糖可用于例如治療革蘭氏陰性細菌感染，此外，GDP-甘露糖對于蛋白質糖基化的人源化是重要的，其對于某些治療性蛋白質的產生是必不可少的(18、30)。甘露糖基化寡糖和甘露糖基化復合糖還用于藥物靶向，例如，甘露糖基化抗病毒劑可特異性地靶向肝和腎(7)。

本發明提供了遺傳上改變的微生物，以這種方式，它們可以高效地產生后一種化合物。

而且，pH敏感分子(例如但不限于葡糖胺和有機酸(例如但不限于丙酮酸、琥珀酸、己二酸、唾液酸、唾液酸化寡糖...))的合成優選地在低pH下產生以穩定產物或為了下游處理的原因(4、12、40)。因此，可在低pH下生長的菌株對于這些產生方法是有益的。大腸桿菌(E.coli)是可容易地適應多種條件的生物體，例如其可容易地適應胃中嚴酷的pH條件(其為約pH2)(14)。雖然如此，大腸桿菌似乎不在這些條件下生長，但是在靜止期誘導了其酸抗性機制(40)。在該階段期間，細胞不再增殖并因此妨礙了生產率。目前為止，對于這個問題還沒有發現解決方法。然而，在本發明中，提供了遺傳改造的微生物，其可以誘導在指數生長期(其是主要用于產生有機酸和pH不穩定產物的階段)的酸抗性機制。

附圖簡述

圖1：野生型、ΔiclR和ΔarcA突變菌株相對于分批發酵條件下參與可拉酸生物合成之基因的ΔarcAΔiclR突變菌株的基因表達模式。參與可拉酸生物合成的基因在圖3和4中呈現。

圖2：在恒化器(chemostat)發酵條件下野生型、ΔiclR和ΔarcA突變菌株相對于ΔarcAΔiclR突變菌株的可拉酸操縱子基因表達模式。

圖3：可拉酸操作子的基因組構以及這些基因之功能的概覽：