[發(fā)明專利]用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280053749.1
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN104080917B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 阿奈·吉拉爾-加涅潘;埃爾莎·費爾赫芬;迪米特里·拉維爾特;弗朗西斯-盧瓦克·科塞
• 申請（專利權）人: 國家健康與醫(yī)學研究院;里昂高等師范學院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C07K14/15;A61K48/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;謝燕軍

技術領域

本發(fā)明涉及能夠有效基因轉移造血細胞的假型化慢病毒載體。

背景技術

基因治療對于許多遺傳性和獲得性疾病的治愈是有希望的，如其在X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID-X1)、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥和慢性肉芽腫病的治療中的成功所證明的。最近，報道了使用慢病毒載體成功治療患有X-連鎖腎上腺腦白質營養(yǎng)不良(ALD)的患者。在該試驗中，基于造血干細胞(HSC)的基因治療能夠阻止患有這種中樞神經系統(tǒng)的致命性脫髓鞘性疾病的兩名患者的疾病進展。重要的是，為了校正造血系統(tǒng)的所有這些缺陷，必須將治療基因遞送到既能夠自我更新又能夠分化為所有造血譜系的細胞中。由于HSC符合這些標準，所以它們代表基因治療應用的有吸引力的候選。

然而，HSC的慢病毒載體轉導中的主要障礙在于，75％的HSC停留在細胞周期的G₀期，并且對于經典慢病毒載體轉導不是非常容許。該限制阻礙了常規(guī)慢病毒載體用于HSC基因治療的應用，因為它們不允許有效地將基因轉移到靜態(tài)(G₀)HSC的亞群(Sutton等人(1999)J.Virol.73：3649-3660)。為了克服該限制，許多使用慢病毒載體用于hCD34⁺細胞轉導的研究采用高載體輸入且存在非常強的細胞因子雞尾酒(TPO、SCF、Flk-3、IL-6、IL-3)以誘導HSC周期進入。很多時候，纖維連接蛋白(纖連蛋白的片段)用于共定位載體顆粒和靶細胞，或應用多次載體施用以實現HSC中的高基因轉移率。然而，延長細胞因子刺激的不良影響是人HSC的多潛能和長期移植的降低。而且，過高的載體劑量產生多拷貝整合(特別是插入突變)的風險。

因此，對能夠轉導靜態(tài)HSC且限制性多拷貝整合的風險的病毒載體存在需要。

有效地將基因轉移到靜態(tài)T和B淋巴細胞中用于基因治療或免疫治療目的可以允許治療造血系統(tǒng)的幾種遺傳障礙(諸如免疫缺陷)，和對于癌癥和獲得性疾病開發(fā)新的治療策略。慢病毒載體(LV)不能夠轉導一些特定的靜態(tài)細胞類型，諸如靜息T細胞和B細胞(Bovia等人(2003)Blood101：1727-1733；Verhoeyen等人(2003)Blood101：2167-2174)。在T細胞中，用水皰性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的慢病毒載體的基因組的逆轉錄、核輸入(nuclear?import)和隨后整合的完成無法有效進行，除非它們經由T細胞受體或通過誘導它們進入細胞周期的G_1b期的存活-細胞因子而活化。B細胞的慢病毒轉導是另一回事，因為甚至B細胞受體(BCR)刺激誘導增殖也不足以允許VSV-G假型化慢病毒載體(VSV-G-LV)的有效轉導。

因此，對能夠轉導靜息T細胞和B細胞的病毒載體存在重要需要。

為了通過慢病毒載體將基因遞送至造血細胞中，需要將允許有效的載體-細胞融合的“進入”包膜蛋白遞呈在其表面。將異源包膜糖蛋白引入慢病毒載體的核心上的過程被稱為“假型化”。與由HIV-1衍生的病毒核心相關的VSV-G已經使用很長時間。盡管如此，使用VSV-G-LV存在缺點。毒性與VSV-G的長期表達相關，這使得生成穩(wěn)定細胞系變得困難。此外，VSV-G-LV對人補體敏感，這使得它們不適合體內使用。只有高VSV-G-LV劑量(感染復數＝50-100的MOI)允許高效hCD34⁺細胞轉導，這增加了多拷貝整合的風險，從而增加了遺傳毒性的風險(Di?Nunzio等人(2007)Hum.GeneTher.18：811-820)。人類也可以發(fā)展針對VSV-G的強烈免疫應答，這可能降低第二次施用VSV-G-LV的效力。所有這些證據限制VSV-G-LV的體外和體內使用。

包含與鼠白血病病毒A(MLV-A)包膜糖蛋白的胞質尾(被稱為TR)融合的RD114貓白血病病毒包膜糖蛋白的胞外和跨膜結構域的嵌合包膜糖蛋白(下文稱為RD114/TR且在國際申請WO?03/091442中描述)似乎是一種相當好的替代性包膜。事實上，該假型對人補體系統(tǒng)不敏感，這使得其對體內應用具有吸引力。RD114/TR-LV允許有效轉導人和獼猴CD34⁺細胞。然而，轉導水平保持遠低于VSV-G-LV的轉導水平，且RD114的滴度遠低于VSV-G-LV的滴度。此外，RD114/TR糖蛋白不能有效進入鼠細胞。所以，該受體特異性限制了該LV起作用的潛力，因為大多數適合用于基因治療的臨床前疾病模型是小鼠模型。

發(fā)明概述