[發明專利]犬源化腫瘤壞死因子抗體及其使用方法

無效

• 申請號: 201280052125.8
• 申請日: 2012-08-29
• 公開（公告）號: CN103958545A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 大衛·吉爾芮
• 申請（專利權）人: NVIP私人有限公司
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;C12N15/13;A61P37/06;A61K39/395
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;劉成春

技術領域

本發明涉及充當犬腫瘤壞死因子α抑制劑的結合抗體及其片段。本發明延及制備這些抗體及其片段的方法以及這些結合抗體和片段在治療犬的由腫瘤壞死因子介導的慢性炎癥病癥如關節炎中的治療用途。

發明背景

腫瘤壞死因子α(TNF-α、TNF-α、TNF)是在免疫、炎癥、細胞增殖控制、分化和細胞凋亡方面發揮多效性功能的有效細胞因子。已經證明，使用腫瘤壞死因子受體(TNFR)免疫球蛋白Fc結構域融合蛋白或抗TNF中和單克隆抗體抑制TNF是治療包括風濕病關節炎和銀屑病性關節炎在內的各種人炎性疾病的成功的治療途徑。

寵物動物如狗會發生類似的炎性疾病，包括骨關節炎、免疫介導的多發性關節炎、血漿-淋巴細胞滑膜炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、血管炎和各種自身免疫性皮膚疾病。據估計，在美國五分之一的成年狗有關節炎，并且狗被用作人關節疾病如骨關節炎、前交叉韌帶撕裂和半月板損傷的模型。

已有大量的文件證明TNF在狗發生炎癥中的作用。例如，封閉的胸部模型中由球囊閉塞引起缺血再灌注后，用TNF抑制劑依那西普(huTNFR-Fc)處理狗，使心肌損傷降低約25-40％，同時伴隨有相關的炎癥標記物如ICΑM-1和NF-kB的減少。同樣，也已經證明，在缺血-再灌注的開胸狗模型中使用2mg/kg?TNFR-Fc，梗死面積降低60％。

而且，在患有膝關節炎的狗的滑液的細胞浸潤物中，TNF-α的分泌增加。已經顯示，在患有青光眼的狗的中心視網膜和外圍視網膜中，作為廣泛的炎性反應的一部分，TNF受體和II型TNF受體顯著增加。抗犬TNF?MAb已用于通過捕捉ELISA法檢測用LPS處理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF。還報道過，在犬血管外皮細胞瘤、成視網膜細胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大細胞瘤的皮膚樣品中存在TNF-α表達。在骨關節炎的誘導模型中，犬關節軟骨中存在TNF-α受體和TNF受體。已經在患剝脫性皮膚型紅斑狼瘡(ECLE)的兩只狗中測試了抗TNF的人源化單克隆抗體阿達木單抗(每兩周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病進展照舊且血清TNF-α水平無變化。

由于TNF參與犬的各種炎性介導的病癥，因此需要可用于長期抑制TNF的犬TNF抑制劑，從而預防或治療所述慢性炎性病癥。

發明概述

經過大量的努力，本發明人意外地確定出一種制備抗體的方法，該方法產生了特異性結合犬TNF且中和犬TNF的生物活性的抗體和結合片段。特別是，本文表明，盡管在該抗體的框架區中引入了大量的氨基酸修飾，由于這些修飾是以新穎的和創造性的方式作出的，因此本發明的抗體和結合片段仍然以高特異性結合犬TNF。進一步證明，該結合通過抑制犬TNF與TNF受體表達的細胞膜結合來使犬TNF的生物活性減退。因而，這將能夠預防犬的TNF介導的誘導的發生、炎性介導的疾病如關節炎的發展或進展。

使用重組DNA方法生產本發明的抗體，且本發明的抗體顯示對犬TNF的結合特異性，同時還具有犬的框架和恒定結構域序列，以降低將其施用至犬宿主時它們的免疫原性。結果，使異種抗體誘導的風險最小。由于使用標準方法如CDR移植等不能產生該抗體，因此對犬TNF的結合特異性完全是出人意料且意想不到的。

根據本發明的第一方面，提供了特異性結合犬腫瘤壞死因子(TNF)犬源化抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方案中，通過下述方法制備該抗體，其包括或基本上由以下步驟組成：

-提供來自犬之外的物種的供體抗體，其中所述供體抗體對腫瘤壞死因子具有結合特異性；

-將所述供體抗體框架區氨基酸序列的每一氨基酸殘基與存在于一個或多個犬抗體框架區的氨基酸序列中對應位置的每一氨基酸殘基進行比較，以鑒別出所述供體受體框架區氨基酸序列內與所述一個或多個犬抗體框架區的氨基酸序列的對應位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及

-用存在于一個或多個犬抗體中對應位置的一個或多個氨基酸殘基取代所述供體抗體中一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。

上述方法修飾了犬中使用的供體抗體，通過這種方式使得修飾的抗體的框架區內的任何位置不含有對犬中的該位置而言是外來的任何氨基酸。因此，修飾的抗體保留了供體抗體對靶抗原的特異性和親和性，但重要的是這種修飾并沒有產生潛在的外來表位。因此，犬中修飾的抗體并不視為是外來的，并因此沒有引起可能導致中和抗體功效的免疫反應，尤其是在長期施用后。