[發明專利]巖藻糖基化抗體的分離方法

在審

• 申請號: 201280051644.2
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN103890002A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: A·弗萊莫斯-格林德朔貝爾;C·耶格爾;P·松德爾曼;P·烏馬納
• 申請（專利權）人: 羅切格利卡特公司
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K16/00;C07K14/705
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

發明領域

本發明涉及抗體的分離方法，具體為具有不同巖藻糖基化程度的抗體的分離方法。所述方法基于抗體對Fc受體的結合親和力。本發明進一步涉及將Fc受體用于分離具有不同巖藻糖基化程度的抗體。

背景

人IgG₁由兩種Fab(抗原結合片段)片段組成，所述片段包含負責抗原識別的可變區，以及與免疫系統的組分相互作用并介導免疫效應子功能的恒定Fc(可結晶片段)結構域，所述免疫效應子功能例如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。連接到恒定區的CH2結構域內在天冬酰胺297(Asn297，N297)處的保守的N-糖基化位點的碳水化合物結構對于介導這些效應子功能而言是必需的(1-4)。

天然地，連接到Fc結構域的寡糖主要是在平分型GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)、末端半乳糖、核心巖藻糖和唾液酸的含量方面不同的雙觸角(biantennary)復合型結構(圖1)。

近期研究已顯示，碳水化合物組合物的修飾強烈影響抗體介導的免疫效應子功能(3-5)。低水平的半乳糖基化積極影響補體激活，同時缺乏核心巖藻糖導致對FcγRIIIa更高的結合親和力并由此增強ADCC(5-7)。已經開發了多種方法以調控糖基化特征以及生成具有改進的生物功能的治療性抗體(8-10)。

例如，過表達β(1,4)-N-乙酰葡糖胺轉移酶(GnT)III和甘露糖苷酶(Man)II的哺乳動物細胞中產生的糖改造的抗體以高比例的二等分、非巖藻糖基化寡糖為特征，并且由于對FcγRIIIa多達50倍的更高親和力而引起增強的ADCC(9)。然而，通過GnT?III的過表達引入的碳水化合物修飾抑制巖藻糖基化反應，所述碳水化合物修飾導致僅部分非巖藻糖基化的抗體。由于IgG分子的Fc結構域帶有兩個N-連接糖基化位點，巖藻糖基化反應的部分抑制可導致抗體庫內巖藻糖的分布改變。此類抗體制劑可能含有帶有一個或兩個巖藻糖殘基的分子的混合物，而它們中的一些是完全非巖藻糖基化的。顯然，此類非巖藻糖基化的不同程度影響對FcγRIIIa的總體親和力并導致不同生物活性。因此，此類抗體庫的詳細鑒定是必需的。

巖藻糖基化和非巖藻糖基化IgG對FcγRIIIa的親和力之間的差異為至多50倍，因此可以利用該相互作用來分離抗體庫中不同巖藻糖基化的種類并獨立地表征它們。

用于IgG純化的現有親和層析基質不能區分IgG庫中不同的糖基化模式，因為固定化捕獲蛋白質特異性結合抗體的蛋白質骨架。例如蛋白質A和蛋白質G在Fc區的CH2和CH3結構域之間的界面內結合，而其它IgG特異性蛋白例如蛋白質L識別kappa輕鏈的恒定部分(11-13)。

已經采用凝集素親和層析，例如使用結合含有巖藻糖的聚糖的橙黃網胞盤菌凝集素(AAL)以富集帶有特異性聚糖結構的蛋白質(14)?？蛇x地，已經使用識別特異性碳水化合物結構的聚糖-靶向抗體，例如Lewis?x抗原的特異性抗體(15)。盡管這些方法可適于富集帶有特異性碳水化合物的糖蛋白，然而所述方法對于缺乏特異性碳水化合物的糖蛋白，例如非巖藻糖基化的抗體的富集用途有限。此外，這些方法對于抗體都不是特異性的，因此在將抗體庫應用至親和力基質之前要求嚴格純化所述抗體庫，以避免受其它帶有靶向聚糖結構的蛋白質污染。最終，這些方法依賴于可能難以獲得的特異性凝集素或抗體，并且所述方法尚未成功用于制備目的。

鑒于部分或完全非巖藻糖基化的抗體在誘導免疫效應子功能中的效價大大增加(這是對于實驗以及治療目的所關注的)，期望從來自抗體庫中存在的完全巖藻糖基化的抗體中分離所述部分或完全非巖藻糖基化的抗體。本發明提供簡單且有效的方法來實現此類分離。

發明描述

本發明提供的分離方法基于某些Fc受體例如FcRγIIIa區分巖藻糖基化和(部分或全部)非巖藻糖基化抗體的能力。所述方法使用固定化Fc受體從抗體庫分離不同巖藻糖基化的抗體，用于分析和制備目的?？蓪⒈疚拿枋龅姆椒ǚ治龅貞糜诒碚骺贵w庫的碳水化合物組成。由于所述方法可篩選大量樣品，例如，可將其用于選擇產生具有高非巖藻糖基化寡糖含量的糖改造的抗體的宿主細胞克隆。制備應用可制備完全非巖藻糖基化或完全巖藻糖基化抗體群，可表征所述抗體群的不同FcγRIIIa結合性質和生物活性。

在第一方面，本發明提供用于分離具有不同巖藻糖基化程度的抗體的方法，其包括以下步驟：

a)提供抗體的群，

b)使所述抗體的群與固定在載體上的Fc受體接觸，