[發(fā)明專利]通過反向脂肪酸氧化的官能化羧酸和醇

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280051477.1
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN103998600A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: R·岡薩雷斯;J·M·克羅姆伯格
• 申請（專利權(quán)）人: 威廉馬什萊斯大學(xué)
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 北京嘉和天工知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11269
• 代理人: 甘玲

在先相關(guān)申請

本申請要求2011年9月7日提交的美國序列號61/531/911的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明僅針對美國目的要求2011年2月7日提交的61/440,192的優(yōu)先權(quán)，其通過引用整體并入。

聯(lián)邦資助研究聲明

本發(fā)明是在由國家科學(xué)基金頒發(fā)的CBET-1134541和CBET-1134541以及CBET-1067565撥款下借助政府資助進行的。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及可以制備各種化學(xué)品用于工業(yè)用途的工程微生物。特別地，反向驅(qū)動脂肪酸氧化途徑，將脂肪酸轉(zhuǎn)化成原料和具有較少碳的專用化學(xué)品。

發(fā)明背景

我們已經(jīng)表明β-氧化循環(huán)的工程化逆轉(zhuǎn)可用于產(chǎn)生具有不同長度和官能度的側(cè)鏈的直鏈脂族羧酸和正醇(61/440,192和PCT/US12/24051，2012年2月7日提交并且兩者均通過引用整體并入本文)。在所有情況下，合成的分子為在ω末端處具有甲基的伯正醇或羧酸。本發(fā)明繼續(xù)在反向β-氧化應(yīng)用中進行研究并允許產(chǎn)物的進一步多樣化。

為了概述在先基礎(chǔ)的突破工作，用于驅(qū)動反向β-氧化循環(huán)的方法涉及以下三步：1)在不存在其天然誘導(dǎo)底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情況下功能性表達β氧化循環(huán)酶；2)在反向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)(與其天然分解代謝/降解方向相反)；和3)表達作用于β氧化循環(huán)的合適的中間體的終止酶以制備所需產(chǎn)物。

更詳細地，重組工程為：

1)在不存在其天然誘導(dǎo)底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情況下表達β-氧化循環(huán):為了表達β-氧化循環(huán)，首先i)突變fadR和atoC(c)使得在不存在脂肪酸的情況下表達編碼β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(ΔarcA)使得在厭氧/微需氧的條件下編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因能夠表達(在燃料和化學(xué)品的生產(chǎn)中使用微需氧/厭氧條件但是導(dǎo)致β氧化基因被ArcA抑制)；和iii)用cAMP非依賴性突變體(crp*)替換天然的環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白(crp)使得在存在分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源諸如葡萄糖(葡萄糖為在發(fā)酵過程中最廣泛使用的碳源且抑制β氧化基因)的情況下表達編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因。

2)以反向/生物合成方向驅(qū)動β氧化循環(huán)(與其天然分解代謝/降解方向相反)。除了功能性表達β-氧化循環(huán)，本途徑的反向運行通過驅(qū)動朝向β氧化循環(huán)的乙酰-CoA及其前體并防止別處A-coA使用來驅(qū)動。具體地說，iv)使用微需氧/厭氧條件使通過TCA循環(huán)進行的乙酰-CoA的代謝最小化并制備可用來在反向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)的乙酰-CoA；v)pta(或ackA或兩者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除減少由乙酰-CoA合成乙酸鹽(Δpta或ΔackA和poxB)和乙醇(ΔadhE、ΔyqhD和ΔeutE)并因此制備可用來在反向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)的乙酰-CoA；vi)硫解酶的過度表達，在β氧化循環(huán)的逆轉(zhuǎn)中的第一步，使得乙酰-CoA引導(dǎo)至本途徑并因此以相反方向運行；vii)ldhA、mgsA和frdA敲除分別減少由丙酮酸鹽和磷酸烯醇丙酮酸鹽合成乳酸鹽(ΔldhA和ΔmgsA)和琥珀酸鹽(ΔfrdA)，從而制備用于合成乙酰-CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸鹽和丙酮酸鹽且因此制備可用來在反向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)的乙酰-CoA；viii)丙酮酸鹽的過度表達：黃素氧還蛋白氧化還原酶(ydbK)和酰基-CoA脫氫酶(ydiO和ydiQRST)使得丙酮酸鹽氧化(丙酮酸鹽→乙酰-CoA+CO₂+Fd_red)和反式-Δ²-烯酰-CoA還原(反式-Δ²-烯酰-CoA+Fd_red→酰基-CoA)偶聯(lián)并因此以相反方向驅(qū)動β氧化。

3)CoA硫酯中間體至所需終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。描述將反應(yīng)中間體從反向β-氧化循環(huán)抽出并產(chǎn)生所需終產(chǎn)物的若干終止酶：

i)針對羧酸(即短的、中等和長鏈單羧酸，β-酮酸，β-羥基酸，反式-Δ2-脂肪酸)的CoA硫酯水解酶/硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和羧酸激酶，