[發明專利]色譜純化方法和設備

有效

• 申請號: 201280049023.0
• 申請日: 2012-09-15
• 公開（公告）號: CN103842045A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: R.斯庫達斯
• 申請（專利權）人: 默克專利股份公司
• 主分類號: B01D15/18
• 分類號: B01D15/18;B01D15/36;B01D15/38;G01N30/46
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 童春媛;萬雪松

本發明涉及適用于僅需要三根分離柱的連續色譜過程的方法和設備。該過程是一種包含兩個色譜步驟的兩步程序。第一色譜步驟(捕獲)在優選的兩根分離柱上交替且循序地進行，第二色譜步驟(精純，polishing)也循序地在第三根分離柱上進行。

發明背景

蛋白質的大規模且經濟性的純化逐漸成為生物技術和制藥工業中的重要問題。一般地，采用設計以產生目標蛋白的哺乳動物或菌細胞株，通過插入含有用于該蛋白的基因的重組質粒進行細胞培養來產生蛋白質。由于所用的細胞系為生物體，所以它們必須供給復合的生長培養基，包含糖、氨基酸和生長因子，通常從動物血清制品中提供。從供給細胞的化合物混合物中和從細胞本身的副產物中，將所需的蛋白質分離至足以用作人類治療劑的純度是一種巨大的挑戰。

從細胞碎片中進行蛋白純化的程序首先取決于蛋白質表達的位置。某些蛋白質被引起從細胞中直接分泌至周圍生長培養基中；其它的則是在細胞內制造。對于后者的蛋白質，純化過程的第一步包含細胞的裂解，其可以通過多種方法進行，包括機械剪切、滲壓震擾或酶處理。此類裂解將細胞的全部內含物釋放到勻漿中，并且另外會產生由于其體積小而難以除去的亞細胞碎片。這些碎片通常通過離心或過濾除去。對于在蛋白質生產運行過程中由于細胞的自然死亡以及細胞內宿主細胞蛋白質的釋放而直接分泌的蛋白質，同樣的問題會出現，盡管規模較小。

因此，目前所使用的典型的純化過程包括以下步驟：

-?進行細胞溶解以回收細胞內蛋白質，或在分泌性蛋白質的情況下從培養基回收蛋白質，

-使用例如差速離心或過濾除去細胞碎片，以得到含有目標蛋白質的澄清樣品，

-?在多步驟過程中利用多種色譜介質，將目標蛋白質與樣品中的其它蛋白質和各種其它雜質分離。

色譜技術一般基于蛋白質的電荷、疏水程度或大小進行蛋白質混合物的分離。數種不同的色譜樹脂可用于各自這些技術，使得將所屬純化方案精準地適用于所涉及的特定蛋白。這些分離方法各自的實質就是使得蛋白質順著長的柱以不同的速率移動，實現隨著蛋白質沿著柱進一步移動而增加的物理分離，或者選擇性吸附于分離介質，然后被不同的溶劑進行差別性洗脫。在某些情況下，當雜質特異性吸附于柱上而目標蛋白質沒有被吸附時，可將所需蛋白質從雜質中分離出來，即目標蛋白質存在于“流通(flow-through)”中。

因可交換的反離子命名的離子交換色譜法是一種適用于純化可離子化分子的程序。分離離子化的分子，是基于它們的帶電荷基團與連接于固相載體基質上的帶有相反電荷的分子的非特異性靜電作用，從而遲滯那些與固相更強烈相互作用的離子化分子。各類型離子化分子的凈電荷和其對基質的親和力根據帶電荷基團的數量、各基團的電荷以及競爭與帶電荷固相基質的相互作用的分子的性質而變化。這些差異引起經離子交換色譜的各種分子類型的拆分。在使用離子交換色譜法的典型蛋白質純化中，源于宿主細胞的許多蛋白質的混合物(如在哺乳動物細胞培養中)，被應用于離子交換柱。未結合分子被沖掉后，可調整條件，如以梯級或梯度模式改變pH、反離子濃度等，以從固相中釋放非特異性保留或延遲的離子化的目標蛋白質，并將其與具有不同電荷特征的蛋白質分離。陰離子交換色譜法涉及在pH和特定分離過程的條件下，陰離子目標分子與負性反離子對連接于固相基質的帶正電荷分子的相互作用的競爭。與之相反，陽離子交換色譜涉及在pH和特定分離過程的條件下，陽離子目標分子與正性反離子對連接在固相基質上的帶負電荷分子的競爭?；旌夏Ｊ降碾x子交換色譜法涉及在相同步驟中陽離子和陰離子交換色譜介質的組合的使用。特別是，“混合模式”是指一種固相載體基質，其共價性連接有陽離子交換和/或陰離子交換與疏水作用基團的混合物。

親和色譜法，其利用待純化蛋白質與固定化捕獲劑之間特定的結構依賴性(即空間互補性)相互作用，是一種對某些蛋白質(如抗體)的標準純化選項。蛋白質A，例如是包含Fc區域的蛋白質(如抗體)的親和色譜法的有用的吸附劑。蛋白質A是一種源自金黃色葡萄球菌的41kD細胞壁蛋白質，其以高親和力(對人IgG約10^-8M)與抗體的Fc區域結合。雖然用途普遍，但親和色譜法成本高，特別是在必須用來純化治療性蛋白質的工業規模上。

又一色譜法是羥磷灰石色譜法或疏水作用色譜法(HIC)。