[發(fā)明專利]焦磷酸的測定方法以及SNP分型方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280004414.0
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN103299179A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設計）人: 田中浩之
• 申請（專利權）人: 松下電器產業(yè)株式會社
• 主分類號: G01N27/28
• 分類號: G01N27/28;C12Q1/26;C12Q1/32;C12Q1/42;C12Q1/68;G01N27/416;C12N15/09
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 翟赟琪

技術領域

本發(fā)明涉及在小型傳感器中高靈敏度并且穩(wěn)定地測定試樣溶液中的焦磷酸的方法、以及使用該方法的SNP分型方法。

背景技術

近年來，包括體外診斷藥的分子診斷市場快速發(fā)展，與基因信息相關的技術正在積極開發(fā)。在醫(yī)療領域中，通過分析疾病相關基因，實現(xiàn)疾病的分子水平上的治療。通過使用基因分析的診斷，也能夠實現(xiàn)針對每個患者的定制醫(yī)療。定制醫(yī)療中，進行藥物治療前的體質診斷和感染癥的診斷，分析各種基因信息，對每個患者進行適當?shù)闹委熀徒o藥。因此，優(yōu)選這樣的診斷，要求POCT(即時檢驗，Point?of?Care?Testing)性高、迅速、簡便的方法。

另外，在基因信息中，基因多態(tài)性特別重要。為了使我們的容貌和體型等各種各樣，每個人的基因信息也相當大的部分不同。在這些基因信息的差異中，堿基序列的變化以人口的1％以上的頻率存在，這被稱為基因多態(tài)性。這些基因多態(tài)性不僅與個人的容貌有關，而且據(jù)說與各種基因疾病的原因、體質、藥劑應答性、藥劑的副作用等相關。目前，正在快速考察這些基因多態(tài)性與疾病等的相關性。

該基因多態(tài)性中，近年來，SNP(單核苷酸多態(tài)性，Single?nucleotidepolymorphism)特別受注目。SNP是指在基因信息的堿基序列中僅一個堿基不同的基因多態(tài)性。SNP在人類基因組DNA內據(jù)稱有2～3百萬，容易作為基因多態(tài)性的標記利用。因此，期待SNP在臨床上的應用。目前，作為SNP相關技術，進行了基因組中的SNP的位置鑒定以及SNP與疾病的相關性性等的研究，同時進行了判定SNP部位的堿基的SNP分型技術的開發(fā)。

作為SNP分型的技術，有：利用雜交的技術、利用限制性酶的技術、利用連接酶等酶的技術等各種技術。這些技術中，作為最簡便的技術，具有：利用引物延長反應的技術。該技術中，通過判定是否引起引物延長反應，進行SNP分型。作為通過利用引物延長反應的SNP分型技術進行的檢測方法，考察了使用熒光色素檢測實際的DNA的擴增產物的方法、和使用固定化探針電極進行電檢測的方法。除了這些方法之外，也考察了檢測作為利用DNA聚合酶的核酸合成的副產物的焦磷酸的方法。該方法中，為了檢測延長反應的進行的差異，將伴隨引物延長反應的進行而生成的焦磷酸轉變成ATP，然后，利用熒光素酶反應，測定焦磷酸的量(參照非專利文獻1)

另一方面，研究了通過酶反應特異性地檢測DNA延長反應的過程中產生的焦磷酸的方法。具有如下方法：使ATP硫酸化酶作用于焦磷酸后，在熒光素酶-熒光素反應中生成光，由此進行檢測(專利文獻1)。

但是，該方法在進行光檢測的方面，具有裝置變大型的課題。

另一方面，研究了不使用光檢測而對焦磷酸進行電化學檢測的方法。

根據(jù)專利文獻2，公開了如下方法：相含有具有與DNA的SNP序列互補的序列、并且具有SNP部位的DNA探針和、DNA聚合酶(DNAポリメ一ラ一ザ)、脫氧核苷酸的反應體系中供應試樣，通過PCR反應，使DNA探針延長，將伴隨DNA探針的延長反應而生成的焦磷酸通過焦磷酸酶恢復至無機磷酸，進而，使用包括3-磷酸甘油醛、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、3-磷酸甘油醛脫氫酶、心肌黃酶以及作為電子介質的鐵氰化鉀的測定系統(tǒng)，最終通過電極測定電流值，由此，對DNA的SNP序列進行分型。闡述了根據(jù)該方法，能夠在將含有焦磷酸的試樣加入到測定系統(tǒng)中后100秒以內判定SNP序列。

該方法中，焦磷酸的測定以及SNP的分型可以通過將電子介質的氧化還原反應進行電化學測定來實現(xiàn)。該方法作為無需光學系統(tǒng)的簡便并且高靈敏度的方法公開(專利文獻2)。

另外，公開了通過將反應體系的緩沖液成分以及酶等最佳分離并配置，能夠使測定高靈敏度化。(專利文獻3)

這些檢測方法中進行SNP分型時，首先，作為檢體，從患者的血液等中提取DNA的模板。此時，為了盡可能減小患者的身體上以及精神上的負擔，強烈要求從患者攝取的檢體的量盡可能少量就能完成。另外，診斷項目涉及多方面的情況下，由于同時進行多種SNP分型，因此，使用多個傳感器元件。此時，強烈期望在一個傳感器元件中用于檢測的檢體的量盡可能少量就能完成。根據(jù)這些背景，開發(fā)與少量的試樣溶液對應的、小型的SNP分型傳感器的要求非常強烈。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2002-369698號公報

專利文獻2：國際公開第03/078655號

專利文獻3：日本專利第4202407號公報

非專利文獻