[發明專利]一種轉基因作物雙重基因的可視化定量篩查新方法

在審

• 申請號: 201810129688.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108251501A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 許文濤;黃昆侖;羅云波;田晶晶;杜再慧
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/6895
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明所建立的基于超快速PCR和膠體金免疫層析試紙的篩查方法和生物傳感器，使轉基因作物的整體篩查時間控制在10分鐘左右，比傳統方法更快捷、更靈敏，具備特異性強、靈敏度高、檢測結果可靠等優點，可以簡化分析檢測步驟，縮短分析時間，更重要的是使在線實時檢測成為可能，便于攜帶和野外作業，在轉基因作物快速篩查領域，具有非常好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種定量篩查轉基因作物雙重基因的可視化新方法。

背景技術

自1994年轉基因番茄在美國首次商業化種植以來,轉基因技術在農業生產領域得到了快速的應用與發展,轉基因作物的種植面積逐年擴大,已經對現代農業產生了巨大的沖擊和深刻的影響。據國際農業生物技術應用服務組織統計,2014年種植轉基因作物的國家達到28個,并且全球轉基因作物種植面積由1996年的170萬公頃增加到2014年的1.81億公頃,轉基因作物的種植面積增加超過100倍。隨著轉基因作物種植的迅猛發展,關于轉基因生物及其產品成分食用和環境安全性的爭議也與日俱增,相應的爭議事件也頻頻出現。巴西堅果過敏事件、帝王蝶事件、墨西哥玉米轉基因污染事件、轉基因玉米MON863對小鼠肝腎毒性事件、食用轉基因玉米Mon810后小鼠免疫表型異常事件及孕婦胎兒血液CryAb1毒素(Bt蛋白)事件等。雖然以上種種爭議事件后續都被證實缺乏實驗設計、統計或結論的科學性,或者缺少官方正面申明,但是關于對轉基因生物及其產品成分食用和環境安全性的懷疑從未停息,還有愈演愈烈的趨勢。因此,世界各國都在不同程度上制訂了相應的管理制度,主要包括安全性評價制度和轉基因成分標識制度等。由于不同國家和地區在轉基因產品的閾值范圍、標識方式等管理制度上的差異,直接關系到轉基因產品的進出口檢疫、國際貿易互認等諸多問題,加之轉基因生物及其產品成分食用和環境安全性越來越被社會公眾所廣泛關注,直接推動了轉基因檢測技術近年來的快速發展和廣泛應用。目前國內外對轉基因作物及其相關制品的檢測主要是基于外源蛋白靶標和外源核酸成分的檢測來展開的,建立了一系列常見的快速、靈敏的轉基因定性和定量檢測技術,如酶聯免疫吸附技術(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、PCR技術、等溫擴增技術(isothermalamplification)、基因芯片技術(genechip)及數字PCR技術(digital PCR,d PCR)等,但在雙重基因的超快速、定量、可視化篩查方面還存在諸多問題。

發明內容

本發明建立的可視化定量篩查新方法，克服了現有篩查技術的不足，實現了對轉基因作物進行準確、快速、簡單高效的篩查和分析。

本發明的一個目的是提供一種基因篩查方法，所述方法包括超快速PCR反應,所述超快速PCR反應的反應體系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括帶有免疫標記的可特異性擴增待測目標的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括帶有免疫標記的可特異性擴增待測目標的核苷酸序列；所述超快速PCR反應的反應過程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40個循環。

具體的，所述免疫標記包括生物素、Cy5和/或地高辛。

具體的，所述標記可在所述可特異性擴增待測目標的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一個核苷酸上進行標記；所述任一標記的標記方法均屬于現有技術。

所述可特異性擴增待測目標的核苷酸序列具體包括根據待測目標的特征序列所設計的引物序列；所述特征序列包括現有技術或公知常識所定義的特征序列；所述設計包括現有技術或公知常識所記載的設計方法；所述待測目標包括轉基因產品；再具體的，所述待測目標包括轉基因產品中的外源基因。

具體的，所述超快速PCR反應的反應體系中上游引物和下游引物的濃度為普通PCR濃度的10倍以上；再具體的，為20倍；所述超快速PCR反應的反應體系中還包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的濃度為普通PCR濃度的10倍以上，再具體的，為60倍。

具體的，所述超快速PCR反應的反應過程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30個循環。