[發(fā)明專利]一種植物乳桿菌定量檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210594264.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN102994644A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳臣;任婧;周方方;艾連中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 光明乳業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/25
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是涉及一種植物乳桿菌定量檢測(cè)方法，所述植物乳桿菌定量檢測(cè)方法是定量熒光PCR方法，一種植物乳桿菌定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）是乳酸桿菌中的一種，與人類的生活關(guān)系密切，常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中。植物乳桿菌作為人體胃腸道的益生菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能，因而被廣泛的作為益生菌添加到功能性食品與保健品中。大量研究表明，只有產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/ML才能夠發(fā)揮其應(yīng)有的功效，因而益生菌活菌數(shù)量是評(píng)價(jià)益生菌制品質(zhì)量的重要指標(biāo)。然而目前對(duì)多菌復(fù)合產(chǎn)品中的植物乳桿菌的定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法。傳統(tǒng)生理生化方法易受選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測(cè)效率有限，且耗時(shí)時(shí)間長，一般要2-3天；以16S?rDNA序列同源性分析作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系研究已被普遍應(yīng)用于乳酸菌的分類鑒定中，但由于植物乳桿菌與戊糖乳桿菌、副植物乳桿菌等具有99%的相似性，利用該方法只能鑒定到屬而無法準(zhǔn)確到種。

伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，大量乳酸菌菌株的基因組圖譜已被解析。這些基因組數(shù)據(jù)可以使我們了解不同益生菌的遺傳結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，找出不同菌株的專有特征，從而為不同種乳酸菌的區(qū)分和鑒定奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）的菌數(shù)檢測(cè)方法易受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，并且檢測(cè)耗時(shí)時(shí)間長，檢測(cè)效率較低的缺陷，提供一種植物乳桿菌定量檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明所述植物乳桿菌定量檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單、迅捷，能極大提高乳制品中乳桿菌數(shù)量的檢出效率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）定量檢測(cè)方法，其中所述方法包括以下步驟：

（1）提取待檢樣品的總RNA；

（2）將步驟（1）提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

（3）采用特異性擴(kuò)增植物乳桿菌的引物對(duì)，以步驟（2）所得cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其中所述特異性擴(kuò)增植物乳桿菌的引物對(duì)為：上游檢測(cè)引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:1所示；下游檢測(cè)引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:2所示；

（4）通過比較待檢樣品的Ct值和定量外標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中植物乳桿菌的數(shù)量。

本發(fā)明所述植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）也可簡(jiǎn)寫為植物乳桿菌（L.plantarum），其余乳桿菌命名規(guī)則與之相同。

其中步驟（1）所述提取待測(cè)樣品總RNA的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的總RNA提取方法。所述總RNA的提取較佳地為通過本領(lǐng)域各種商用的RNA提取試劑盒進(jìn)行。

其中步驟（2）所述RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄方法。所述反轉(zhuǎn)錄較佳地為利用各種商用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。

其中步驟（3）所述特異性擴(kuò)增植物乳桿菌的引物對(duì)包括上游測(cè)序引物和下游測(cè)序引物，其中：

上游測(cè)序引物：5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ?ID?No:1所示；

下游檢測(cè)引物：5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’，其序列如序列表中SEQ?ID?No:2所示。所述引物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為通過人工合成途徑即得，可以委托服務(wù)商進(jìn)行全序列合成即得。

其中步驟（3）所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)的熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)。所述熒光定量PCR程序較佳地為：（1）94℃～95℃，25～30秒；（2）94℃～95℃，5～15秒，（3）60℃，20～30秒，其中步驟（2）～（3）重復(fù)30～45個(gè)循環(huán)，更佳地為：（1）95℃30S；（2）95℃5S，（3）60℃25S，步驟（2）～（3）重復(fù)40個(gè)循環(huán)；4℃保存。