[發(fā)明專利]一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210592699.6
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103060235A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張彩霞;張曦
• 申請（專利權(quán)）人: 華北制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/485
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡耸聞?wù)所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物原生質(zhì)體制備與再生方法，具體地說是一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法。

背景技術(shù)

四環(huán)素（Tetracycline，TC）是一種抑制細菌蛋白質(zhì)合成的廣譜抗生素，因其分子結(jié)構(gòu)含四并苯基本骨架而得名，主要用于各種革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陽性桿菌的感染治療，在醫(yī)藥、畜牧和農(nóng)業(yè)方面均有廣泛的用途。我國從20世紀60年代開始工業(yè)化生產(chǎn)四環(huán)素，至今已有五十多年的歷史。四環(huán)素產(chǎn)生菌為放線菌中的鏈霉菌屬（Streptomyces），目前，其優(yōu)良菌種的選育主要采用傳統(tǒng)的育種方法，菌種經(jīng)過長期的人工誘變育種和自然分離，已形成較高的生產(chǎn)能力。但是菌種經(jīng)過多種物理和化學(xué)因子誘發(fā)突變之后，不僅遺傳背景變得相當復(fù)雜，而且對誘變劑的耐受性也大大的增強了，因此，利用傳統(tǒng)的育種方法繼續(xù)提高四環(huán)素的產(chǎn)量已經(jīng)越來越困難，菌種誘變率低、選育效果差是困擾四環(huán)素菌種選育工作的主要問題。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新的遺傳育種手段，該育種技術(shù)的優(yōu)點是去除了細胞壁的障礙，采用物理因子或化學(xué)因子對原生質(zhì)體進行誘變處理，能夠提高原生質(zhì)體的突變頻率，在再生菌落中篩選突變株，可以有效提高優(yōu)良菌種的選育效率，利用原生質(zhì)體技術(shù)來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外微生物育種工作者的普遍重視。在探索四環(huán)素原生質(zhì)體育種技術(shù)的過程中，存在的最大問題是沒有關(guān)于四環(huán)類抗生素原生質(zhì)體制備和再生的方法可以借鑒，原生質(zhì)體制備成功后細胞壁的重建過程非常困難，或者是無法產(chǎn)生原生質(zhì)體的再生菌落，或者是只生長基內(nèi)菌絲和極少量氣生菌絲，不能產(chǎn)生孢子絲，造成菌落不能進行正常的傳代。由此極大地限制了原生質(zhì)技術(shù)在四環(huán)素菌種選育工作中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備、再生方法，以解決現(xiàn)有傳統(tǒng)育種技術(shù)中存在的菌種誘變率低及選育效果差的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

本發(fā)明所提供的四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，它包括如下步驟：

a、制備四環(huán)素斜面培養(yǎng)基：稱取小麥麩皮3.0-3.5g，硫酸鎂0.004-0.006g，磷酸氫二鉀0.01-0.12g，磷酸氫二銨0.013-0.015g，瓊脂粉1.3-1.5g，加蒸餾水至100ml；120-124℃條件下濕熱滅菌30分鐘。斜面培養(yǎng)基裝量60ml/茄子瓶。

b、制備孢子懸浮液：將四環(huán)素產(chǎn)生菌接種于斜面培養(yǎng)基上，于33-36℃條件下培養(yǎng)96小時左右，長出外觀質(zhì)量合格的斜面孢子。在無菌條件下加入無菌蒸餾水或菌絲體培養(yǎng)基制成孢子懸浮液，使孢子液濃度在1×10⁸/ml以上。

c、制備菌絲體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖0.8-1.2g，蛋白胨0.3-0.5g，酵母膏0.3-0.5g，磷酸二氫鉀0.1-0.2g，硫酸鎂0.03-0.05g，磷酸氫二鉀0.3-0.4g，甘氨酸0.2-1g，加水至100ml；120-124℃濕熱滅菌30分鐘。

d、制備再生培養(yǎng)基：稱取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0.5g，磷酸二氫鉀0.05-0.10g，碳酸鈣0.1-0.4g，蔗糖0-11g，瓊脂1.0-2.5g，加水至100ml；120-124℃℃濕熱滅菌30分鐘后制成平板培養(yǎng)基。

e、培養(yǎng)菌絲體：

將四環(huán)素孢子懸浮液接種于c步所述菌絲體培養(yǎng)基中，27℃-33℃條件下，震蕩培養(yǎng)22-32小時，離心棄去上清液，得到菌絲體；

f、酶解細胞壁：

將e步驟所得菌絲體中加入穩(wěn)定液，離心洗滌2-4次，加入溶菌酶溶液，使酶的作用濃度為2mg/ml-6mg/ml，30℃-37℃酶解1-3小時，得到酶解液；

g、分離原生質(zhì)體：

酶解液經(jīng)離心先去除沉淀（離心時的優(yōu)選條件為500轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘）。然后再將上清液離心（上清液離心的優(yōu)選條件為轉(zhuǎn)速3500-8000轉(zhuǎn)/分，時間10-15分鐘），獲得原生質(zhì)體；

h、原生質(zhì)體再生：

將g步驟所得的原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌2-4次，加入一定量的穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)后，用穩(wěn)定液對原生質(zhì)體懸浮液進行梯度稀釋，采用夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，33℃-36℃條件下培養(yǎng)5-7天后形成再生菌落。

本發(fā)明所述四環(huán)素產(chǎn)生菌可選用菌種編號CPCC220020的菌種。

本發(fā)明所述的穩(wěn)定液選擇高濃度蔗糖滲透液，其中蔗糖濃度以10-11%為宜。