[發明專利]一種防齲DNA疫苗及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210592602.1
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103007262A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李洪嬌;陸一鳴;向婧潔;王少海;魯瑩;汪大林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61K39/09
• 分類號: A61K39/09;A61K47/36;A61P1/02;A61P31/04
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明屬于口腔預防醫學技術領域，具體涉及一種防齲DNA疫苗及其制備方法與應用。

背景技術

齲病的發病率僅次于流感，嚴重影響人類健康和生存質量。由于我國人口眾多、醫療資源有限，齲病的發病率遠遠高于發達國家，研制易于普及的齲病疫苗以防治齲病、降低齲病發病率對于保障國民健康顯得尤為重要。

變形鏈球菌（Streptococcus?mutans下稱變鏈菌）能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產生酸性代謝產物，引起牙齒脫礦最終導致齲齒，是人類主要的致齲菌。葡糖基轉移酶（glucosyltranferaes?GTFs）和表面蛋白（surface?protein?antigen?PAc）,葡聚糖結合蛋白（glucan-bind?proteins,GBPs）及變形鏈球菌壁相關蛋白A（wall-associated?protein?A?gene，wapA）是變形鏈球菌的重要抗原物質。這些抗原成分參與介導細菌的粘附，在免疫學方面有重要意義。現在所研究變鏈菌的防齲疫苗多利用這幾種抗原物質，將這幾種基因編碼的DNA疫苗載入體內，可誘導血液、唾液中相應IgG、sIgA抗體的產生，有效控制齲病的發生和發展。有Hong?Qian和My?Lien?Dao的研究表明wapA與細菌聚集相關（Hong?Qian?and?My?Lien?Dao.Inactivation?of?the?Streptococcus?mutans?Wall-Associated?Protein?A?Gene(wapA)Results?in?a?Decrease?in?Sucrose?Dependent?Adherence?and?Aggregation.Infect?Immun,1993.61(12):5021-5028）。Lin?Zhu和Jens?Kreth等通過實驗證明wapA在細菌非蔗糖依賴性的聚集中扮演了重要角色，Real-time?RT-PCR顯示蔗糖對wapA的基因有抑制作用，蔗糖濃度降低后，wapA開始大量表達（Zhu?L,Kreth?J,Cross?SE,et?al.Functional?characterization?of?cell-wall-associated?protein?WapA?in?Streptococcus?mutans.Microbiology,2006,152（8）：23952404）。Thomas?K.Han等經過一系列的體外實驗認為WapA起了雙重粘附作用，介導了葡聚糖和細胞外基質蛋白（尤其是Ⅰ型膠原）的粘附（Han?TK,Zhang?C,Dao?ML.Identification?and?characterization?of?collagen-binding?activity?in?Streptococcus?mutans?wall-associated?protein:A?possible?implication?in?dental?root?caries?and?endocarditis.Biochem?Biophys?Res?Commun.2006,343(3):787-792）。

目前尚無文獻報道將wapA用于制備DNA疫苗，并應用于防齲的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種防齲DNA疫苗，本發明的另一目的是提供該防齲DNA疫苗的其制備方法與應用。

本發明提供了一種防齲DNA疫苗，是由變形鏈球菌UA159的wapA蛋白全長基因和真核表達載體pVAX1質粒構成，由于單純的DNA疫苗進入人體后很快會被核酸酶降解，很難進入細胞，為了進一步提高DNA疫苗的免疫能力，本發明將該DNA疫苗以殼聚糖作為載體制備成殼聚糖納米復合物，以期刺激機體免疫應答，產生抗wapA抗體，阻斷變形鏈球菌的粘附和菌斑形成，從而應用于抗齲齒。

本發明提供了一種防齲DNA疫苗，該疫苗中的DNA是由變形鏈球菌UA159的wapA蛋白全長基因和真核表達載體pVAX1質粒構成。

所述的一種防齲DNA疫苗，該疫苗中的DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發明的另一方面，提供了上述的防齲DNA疫苗的制備方法，該制備方法包括如下步驟：

（1）wapA蛋白全長表達基因的克隆；

以UA159基因組為模板擴增獲得wapA蛋白全長基因后，根據wapA蛋白全長表達序列（GENBANK號：NC_004350.2）及pVAX1/lac?z質粒序列設計并合成如下引物：

pVAX1-wapA-F：CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT