[發明專利]卡那霉素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法

無效

• 申請號: 201210592312.7
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103149157A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 向瀏欣;蔡應繁;付于銀;劉吉軍;冉燕子;王秋娟;王小艷
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: G01N21/25
• 分類號: G01N21/25
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種卡那霉素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法。

背景技術

莖瘤芥(Brassica?juncea?var.tumida?Tsen?et?Lee)，又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，該屬包含許多有重要經濟價值的油料、蔬菜、飼料作物，如油菜、白菜、甘藍等，莖瘤芥為榨菜的主要原料，口感鮮嫩、營養豐富，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。

多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。

莖瘤芥轉基因方法目前主要采用的方法為：取外植體進行組織培養，再通過農桿菌浸染外植體使農桿菌中攜帶的外源基因轉化至外植體中從而獲得轉基因植株，農桿菌轉化方法如文獻《芥菜轉基因再生體系的建立》（楊朝輝等，作物學報）和《芥菜cry2基因RNAi載體的構建與遺傳轉化研究》（梁婷等，安徽農業科學），其中農桿菌中的重組表達質粒除攜帶外源基因序列外，通常還有抗生素抗性標記基因以便篩選轉基因植株，當農桿菌侵染外植體后，通過添加相應抗生素以篩選獲得可能的轉基因植株。

通過組培方法篩選獲得的存活下來的植株，由于添加抗生素的濃度和時間可能不適宜（濃度和時間不適宜會導致非轉化體逃離篩選）或者由于采用較低的抗生素濃度篩選（采用較低的抗生素濃度是增加再生苗甚至是轉基因苗數量的方法，因為濃度低則選擇壓小，則愈傷組織會更多地生長和分化，因此非轉化體數量會增多），則再生苗中很可能多數是假轉化體，因此后續必須對這些植株進行進一步的分子生物學篩選，比如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交，甚至Western雜交以確保為轉基因植株。另外，農桿菌侵染獲得的第一代轉基因植株還是雜合子，若要進行功能分析和研究，必須獲得純合子，那么，同樣地，需要進行大量的篩選，篩選放方法仍然為提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交，甚至Western雜交。

然而，提取植株的DNA與RNA、Southern雜交、Northern雜交等這些分子生物學技術需要使用大量試劑和耗材，而且特異性越強的檢測技術所需的費用越昂貴，檢測周期長，并且操作復雜，當篩選的植株的量大時顯然成本高昂而且費時費力。

為節省實驗成本，CN102696477A和CN102217472A分別公開了用卡那霉素溶液浸種篩選轉基因棉花和卡那霉素涂抹葉片篩選轉基因蘿卜的方法，但兩者所采用的卡那霉素濃度高，分別為1000-1500mg/L和1000mg/L，后者篩選時間長，需12天；另外，棉花種子大適合浸種篩選，莖瘤芥種子相對棉花非常小，不適宜對種子進行抗生素處理；而且，不同物種、不同組織對同一濃度抗生素的承受能力均不同，因此，更不能將上述篩選棉花和蘿卜的方法直接應用于莖瘤芥的轉基因篩選。

因此，需要一種快速簡單的篩選轉基因莖瘤芥的方法，尤其是當篩選植株量較大時，可以節約實驗成本和時間成本，以實現初步篩選，縮小后續分子生物學實驗的篩選范圍。

發明內容

鑒于此，為節約實驗成本，縮小分子生物學實驗（如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交，甚至Western雜交等）的篩選范圍，本發明提供一種簡單、低成本的轉基因莖瘤芥初步篩選的方法，采用的技術方案是：

通過切取莖瘤芥植株的一小片葉片，并將切下的葉片于含有生長素和抗生素的水溶液中觀察葉片的黃化程度來判斷是否為轉基因植株，具體方法為：

切取莖瘤芥植株的葉片，放入含6-芐氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的檢測液中，并觀察所述葉片是否黃化死亡，若是則判斷為非轉基因植株，若否則判斷為轉基因植株。無卡那霉素抗性的葉片在一定濃度的卡那霉素溶液中會黃化甚至死亡，即葉片顏色由綠色變為黃色或褐色，由此作為判斷轉基因植株的特征；生長素6-芐氨基腺嘌呤可以幫助切下的葉片保持一定生存能力。