[發(fā)明專利]一種肺炎支原體的培養(yǎng)與檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210587955.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103045518A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙萬(wàn)千;王海晶;楊揚(yáng);楊焱焱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇嘉語(yǔ)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/35
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 王斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種肺炎支原體的培養(yǎng)與檢測(cè)方法，屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肺炎支原體（M.?pneumonia）是人類急性呼吸道感染的重要病原微生物之一，主要通過(guò)呼吸道和飛沫傳播，可引起學(xué)齡兒童和青少年下呼吸道感染，如非典型性肺炎、氣管炎、支氣管炎等；還可引起其他系統(tǒng)的肺外并發(fā)癥，如腦膜炎、腦干炎、心肌炎、心包炎、腎炎等。肺炎支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、有別于細(xì)胞和病毒的原核微生物。其種類繁多、分布廣泛，其大小一般在0.2-0.3um之間，可以通過(guò)一般除菌濾器。

肺炎支原體感染的臨床癥狀具有不典型性，較難與其他原因引起的呼吸道感染進(jìn)行辨別；臨床痰樣本中肺炎支原體通常被吸附、包裹在粘稠的蛋白膠體中，生長(zhǎng)受到限制，且痰樣本中常混有大量不同種類的雜菌，臨床上無(wú)法直接用于液體培養(yǎng)；而痰樣本直接在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，長(zhǎng)出菌落需要3-4天的時(shí)間，且陽(yáng)性率不高；此外，已使用抗生素的臨床痰樣本中受損的支原體，需要一個(gè)復(fù)蘇的過(guò)程，才能快速生長(zhǎng)。這些均成為臨床肺炎支原體檢測(cè)的障礙，因此快速、準(zhǔn)確、有效地檢測(cè)支原體對(duì)臨床疾病的預(yù)防和治療具有十分重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外常用的肺炎支原體檢測(cè)方法有：特異性抗體檢測(cè)技術(shù)、Southern?Blot?、PCR法、分離培養(yǎng)法、代謝抑制試驗(yàn)等。特異性抗體檢測(cè)技術(shù)，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，并且特異性IgM在感染后1周出現(xiàn)，3～4周達(dá)高峰，特異性IgG出現(xiàn)更晚，一般在6周左右。?Southern?Blot對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求很高，不易普遍開展。PCR法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，已被國(guó)家衛(wèi)生部下令禁止用于臨床檢驗(yàn)。代謝抑制試驗(yàn)，需加特異性抗體抑制支原體的生長(zhǎng)，臨床應(yīng)用不多。總的來(lái)說(shuō)，上述方法不僅檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，而且需要一些精密的儀器設(shè)備，需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行試驗(yàn)，使用不方便。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對(duì)肺炎支原體特性設(shè)計(jì)、培養(yǎng)肺炎支原體快捷方便、鑒定肺炎支原體準(zhǔn)確率高、滿足臨床痰樣本培養(yǎng)與檢測(cè)需要、可有效復(fù)蘇肺炎支原體的培養(yǎng)與檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種肺炎支原體的培養(yǎng)與檢測(cè)方法，其包括如下步驟：

步驟一：將臨床痰樣本接種到備有消化培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶Ⅰ中；

步驟二：培養(yǎng)瓶Ⅰ上依次裝配設(shè)置有密封圈Ⅰ、密封圈Ⅱ、墊片、濾膜、濾膜固定裝置的瓶蓋和培養(yǎng)瓶Ⅱ，蓋好底蓋Ⅱ；

步驟三：將上述裝置以培養(yǎng)瓶Ⅰ在下、培養(yǎng)瓶Ⅱ在上的狀態(tài)置于搖床上，在37度恒溫條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)；

步驟四：將上述裝置倒置，即培養(yǎng)瓶Ⅰ在上、培養(yǎng)瓶Ⅱ在下，通過(guò)培養(yǎng)瓶Ⅱ的抽濾口Ⅱ進(jìn)行負(fù)壓抽濾，使菌液由培養(yǎng)瓶Ⅰ流向培養(yǎng)瓶Ⅱ；

步驟五：通過(guò)培養(yǎng)瓶Ⅰ的底蓋Ⅰ向培養(yǎng)瓶Ⅱ內(nèi)加入富集培養(yǎng)液，在37度恒溫條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)；?

步驟六：通過(guò)肉眼和/或儀器觀察培養(yǎng)瓶Ⅱ中培養(yǎng)液的渾濁程度、顏色變化、有無(wú)熒光現(xiàn)象，或加入試劑進(jìn)行進(jìn)一步的觀察。

在步驟六中，所述培養(yǎng)瓶Ⅱ中的培養(yǎng)液鑒定為肺炎支原體呈陽(yáng)性，繼續(xù)進(jìn)行如下操作：

步驟七：更換新的培養(yǎng)瓶Ⅰ、瓶蓋及瓶蓋內(nèi)的配件，再將備有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)支架置入培養(yǎng)瓶Ⅰ內(nèi)，培養(yǎng)盤的正面朝向培養(yǎng)瓶Ⅰ的瓶壁外側(cè)，蓋好底蓋Ⅰ；

步驟八：將上述組裝好的裝置倒置，即培養(yǎng)瓶Ⅰ在下、培養(yǎng)瓶Ⅱ在上，通過(guò)抽濾口Ⅰ進(jìn)行負(fù)壓抽濾，使菌液流入培養(yǎng)瓶Ⅰ，菌液浸沒培養(yǎng)支架，并接種到培養(yǎng)盤內(nèi)的固體培養(yǎng)基上；

步驟九：將上述裝置再次倒置，即培養(yǎng)瓶Ⅰ在上、培養(yǎng)瓶Ⅱ在下，通過(guò)抽濾口Ⅱ進(jìn)行負(fù)壓抽濾，使菌液流入培養(yǎng)瓶Ⅱ；

步驟十：將上述裝置置于培養(yǎng)箱內(nèi)，并在適合肺炎支原體的溫度下培養(yǎng)24～48小時(shí)；

步驟十一：通過(guò)肉眼和/或儀器觀察上述裝置內(nèi)培養(yǎng)支架上培養(yǎng)盤中菌落形態(tài)。

在步驟四和步驟九中，進(jìn)行負(fù)壓抽濾時(shí)，將所述瓶蓋Ⅰ旋松。

在步驟八中，進(jìn)行負(fù)壓抽濾時(shí)，將所述瓶蓋Ⅱ旋松。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明裝置包括培養(yǎng)瓶Ⅰ、蓋中央帶有通孔的瓶蓋、培養(yǎng)瓶Ⅱ，所述瓶蓋內(nèi)部設(shè)置內(nèi)螺紋Ⅰ、內(nèi)螺紋Ⅱ和內(nèi)螺紋Ⅲ將培養(yǎng)瓶Ⅰ、培養(yǎng)瓶Ⅱ與瓶蓋連接，培養(yǎng)瓶Ⅰ內(nèi)注入消化培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶Ⅱ內(nèi)注入富集培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶Ⅰ內(nèi)的培養(yǎng)盤內(nèi)放置培養(yǎng)與檢測(cè)過(guò)的固體培養(yǎng)基。痰樣本中的肺炎支原體通過(guò)分步培養(yǎng)的方法:即痰樣本經(jīng)消化培養(yǎng)液消化、復(fù)蘇，并完成初步增殖、初步鑒定，再通過(guò)選擇增菌培養(yǎng)液進(jìn)行增殖、富集，最后接種到含豐富營(yíng)養(yǎng)的不同功能的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行再增殖，從而完成肺炎支原體的培養(yǎng)和鑒別。