[發明專利]抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物及其制備方法及制劑

有效

• 申請號: 201210587504.9
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號: CN103893760B
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 包晟;楊榮鑒
• 申請（專利權）人: 深圳市雅臣智能生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/40
• 分類號: A61K39/40;A61P15/14;A61P31/04;C12N1/20;A61K35/74;A61K35/744
• 代理公司: 深圳市瑞方達知識產權事務所(普通合伙) 44314
• 代理人: 張秋紅;張約宗

1.一種抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、篩選引致牛乳房炎的代表性耐藥致病菌作為病原體，所述耐藥致病菌為耐藥金黃色葡萄球菌、耐藥停乳鏈球菌、耐藥無乳鏈球菌以及耐藥大腸桿菌中的一種或多種；

S2、將所述耐藥致病菌粉碎處理后，加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得耐藥致病菌復合抗原；

S3、采用所述耐藥致病菌復合抗原對具有高免疫應答能力的選擇產蛋禽類進行免疫，再揀取所產的免疫蛋；

S4、對所述免疫蛋進行消毒，取蛋黃，制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY；

S5、制備引致牛乳房炎的代表性耐藥致病菌的復合噬菌體，包括耐藥致病菌為耐藥金黃色葡萄球菌噬菌體、耐藥停乳鏈球菌噬菌體、耐藥無乳鏈球菌噬菌體以及耐藥大腸桿菌噬菌體；所述步驟S5包括：

1)分別取耐藥金黃色葡萄球菌菌株、耐藥無乳鏈球菌菌株、耐藥停乳鏈球菌菌株、耐藥大腸桿菌菌株各一批，加入無菌水制成四種菌懸液；

2)分別在三倍濃縮的肉膏蛋白胨液體培養基的發酵罐中，加入預處理的污水溶液與耐藥金黃色葡萄球菌、耐藥無乳鏈球菌、耐藥停乳鏈球菌、耐藥大腸桿菌菌懸液中的其中一種菌懸液，37℃培養12～24小時；

3)將以上四種混合培養液高速離心，將離心所得上清液進行真空過濾除菌，并將濾液在37℃培養過夜；

4)分別在肉膏蛋白胨瓊脂平板上加入四種菌懸液中一種，將菌懸液涂布成均勻的薄層，待平板上的菌懸液干后得到平板菌層，分散滴加數滴濾液于平板菌層上面，37℃培養過夜，分別得到無菌生長的耐藥金黃色葡萄球菌噬菌斑、耐藥無乳鏈球菌噬菌斑、耐藥停乳鏈球菌噬菌斑和耐藥大腸桿菌噬菌斑；

5)分別取步驟1)中四種菌懸液接種于液體培養基內，混合均勻；再取上層瓊脂培養基，溶化并冷卻,分別加入步驟4)中對應的噬菌斑的噬菌體混勻；再注入底層培養基上混勻，置37℃培養后過濾除菌，即得到純化的噬菌體；

6)分別將步驟3)制得的四種耐藥菌的過夜培養液按照1﹕100加入到LB液體培養基中，振蕩培養至菌液對數生長前期；以感染復數0.1～1加入對應的步驟5)中制得的四種噬菌體中一種，混合均勻并靜置，隨后振蕩培養至宿主菌完全裂解，噬菌體裂解液離心取上清過濾除菌，制得四種噬菌體中之一種的擴充濾液；

7)將步驟6)制得的四種噬菌體擴充濾液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均勻，得到復合噬菌體；

S6、將所制得的抗牛乳房炎耐藥菌特異性IgY和復合噬菌體按照(1-10):(1-10)比例混合，制得抗牛乳房炎耐藥菌特異性IgY與復合噬菌體組合物。

2.根據權利要求1所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟6)中將噬菌體裂解液8000r/min離心10min，上清用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

3.根據權利要求1所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟S6中將所制得的抗牛乳房炎耐藥菌特異性IgY和復合噬菌體混合，置入攪拌機中充分混合均勻，制得抗牛乳房炎耐藥菌特異性IgY與復合噬菌體組合物。

4.一種抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物，其特征在于，采用權利要求1-3中任意一項所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物的制備方法制得。

5.一種抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物制劑，其特征在于，其中包括根據權利要求1-3中任意一項所述方法制備的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物，還包括針劑輔料或乳膏輔料。

6.根據權利要求5所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物制劑，其特征在于，所述制劑為針劑，所述針劑輔料包括油、表面活性劑、以及蒸餾水。

7.根據權利要求5所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物制劑，其特征在于，所述制劑為乳房灌注劑，所述針劑輔料包括油、表面活性劑、以及蒸餾水。

8.根據權利要求5所述的抗牛乳房炎耐藥菌IgY與復合噬菌體組合物制劑，其特征在于，所述制劑為乳膏，所述乳膏輔料包括油、鈦白粉、以及微粉硅膠。