[發明專利]一種制備肌氨酸氧化酶的方法及應用

無效

• 申請號: 201210578481.5
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103013941A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 劉明;王萌;張傳寶;肖飛;王大光
• 申請（專利權）人: 衛生部北京醫院
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12Q1/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因工程和蛋白表達領域，涉及一種用生物工程技術高效制備肌氨酸氧化酶的方法，產物可用于生產肌氨酸檢測試劑盒。

背景技術

美國密歇根大學安阿伯分校辛萊巖(Chinnaiyan)等發表在2009年2月12日《自然》雜志(Nature?2009，457：910)上的研究稱，一種名為肌氨酸(sarcosine，亦名N-甲基甘氨酸，甘氨酸的代謝物)的物質可有效反映前列腺癌的侵襲性，辨別癌細胞的生長行為(緩慢生長還是高度侵襲)。該研究的另兩個重要發現是：肌氨酸參與了前列腺的癌變過程，是細胞癌變的元兇之一；尿肌氨酸檢測診斷前列腺癌的準確性優于目前臨床上常用的血前列腺特異性抗原(PSA)檢測。

研究者發現，至少有6種代謝物的水平在良惡性前列腺組織中存在顯著差異，其中又以肌氨酸最為顯著。肌氨酸水平在良性前列腺中極低，在局限性前列腺癌中呈現大幅升高，在轉移性前列腺癌中則升得更高。

目前用于檢測肌氨酸的方法主要有液相色譜或氣象色譜與質譜聯用檢測法、肌氨酸氧化酶熒光檢測法、毛細管電泳電化學發光檢測法、肌氨酸氧化酶分光光度檢測法。

色譜-質譜聯用檢測法雖然檢測靈敏度、準確度、精密度均較高，但由于色譜-質譜設備昂貴，檢測成本較高，檢測速度慢，很難大批量檢測，且操作復雜一般人很難掌握。因此，常應用于科研，很難應用臨床大樣本量診斷檢測。

肌氨酸氧化酶熒光檢測法、毛細管電泳電化學發光檢測法其檢測靈敏度、準確度、精密度略低于色譜-質譜聯用檢測法，但也可滿足臨床的需求。此兩種方法的檢測成本較色譜-質譜聯用檢測法已大大降低，但在檢測時仍需購置專門的檢測裝置，如熒光檢測器、毛細光電泳儀等專門設備。并且人工操作的部分很高，對應用于常規臨床檢測來講仍有一定的難度。

肌氨酸氧化酶分光光度檢測法，其檢測成本低、可應用于目前任何一種全自動生化分析儀，可應用于臨床高速大樣本量的檢測需要。

檢測原理：

反應結束后有醌亞胺類有色物質生成造成吸光度的變化與肌氨酸的濃度成正比。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種操作簡單、制備成本低廉，成功率高的制備肌氨酸氧化酶的方法。

1.為實現上述目的，本發明一種制備肌氨酸氧化酶的方法，該方法包括：

1)改造并全基因合成人源化肌氨酸氧化酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；

2)將步驟1)中改造后的肌氨酸氧化酶編碼基因序列插入表達載體中，并用大腸桿菌菌株轉化表達；

3)將轉化表達菌株接種于LB培養基，IPTG誘導；

4)所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；

其中，步驟1)中改造后的全基因合成人源化肌氨酸氧化酶編碼基因序列為：

ATGGCTTCTT?CTACTGGTGA?TCGTTCTCAG?GCTGTTCGTC?ATGGTCTGCG?TGCGAAAGTT

CTGACCCTGG?ACGGCATGAA?CCCGCGTGTT?CGTCGCGTCG?AATACGCCGT?GCGTGGCCCG

ATCGTTCAGC?GTGCTCTGGA?ACTGGAACAA?GAACTGCGTC?AGGGCGTTAA?AAAGCCGTTC

ACCGAGGTTA?TCCGCGCCAA?CATCGGCGAT?GCCCAGGCTA?TGGGTCAGCG?TCCTATCACC

TTCCTGCGCC?AGGTCCTGGC?GCTGTGCGTA?AACCCAGACC?TGCTGAGCTC?TCCGAACTTC

CCGGACGACG?CTAAGAAACG?TGCGGAACGC?ATCCTGCAGG?CATGCGGTGG?CCACAGCCTG

GGCGCTTACA?GCGTTTCCTC?CGGTATCCAG?CTGATTCGTG?AAGATGTTGC?CCGTTACATC

GAGCGCCGTG?ATGGCGGTAT?CCCGGCGGAC?CCTAACAACG?TATTCCTGTC?TACCGGTGCG

TCCGATGCCA?TTGTTACCGT?TCTGAAGCTG?CTGGTGGCTG?GCGAGGGTCA?CACCCGTACC

GGTGTCCTGA?TTCCGATTCC?ACAGTATCCG?CTGTATTCTG?CTACTCTGGC?TGAACTGGGT