[發(fā)明專利]DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒、其制備及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210576548.1
• 申請(qǐng)日: 2012-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103893757A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)曉春;田永帥;蔡林濤;馬軼凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): A61K39/39
• 分類號(hào): A61K39/39;A61K47/36;A61P37/02
• 代理公司: 深圳市科進(jìn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44316
• 代理人: 宋鷹武

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及新型免疫佐劑，具體涉及一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒、其制備方法，及作為免疫佐劑應(yīng)用。

【背景技術(shù)】

目前不斷開(kāi)發(fā)出的新型疫苗具有良好的抗原特異性和低毒性，但疫苗免疫原性較差。盡管已成功制備得到很有希望的抗原，卻并不能誘導(dǎo)出足夠強(qiáng)的預(yù)防作用。例如，可溶性純化蛋白質(zhì)疫苗或蛋白質(zhì)亞單位疫苗的免疫激活作用通常較弱，不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠抗體；單獨(dú)應(yīng)用時(shí)所需抗原量較多，機(jī)體產(chǎn)生的抗體量較少；且還易引起免疫耐受。但這些疫苗在與較匹配佐劑連用時(shí)，以上缺點(diǎn)就會(huì)有所改善。因此開(kāi)發(fā)安全有效的免疫佐劑來(lái)輔助增強(qiáng)疫苗效力，對(duì)于更多新型疫苗在臨床上的成功應(yīng)用具有重要意義。

佐劑的作用方式多種多樣，人們對(duì)其與免疫系統(tǒng)間相互作用的知識(shí)也正在逐漸豐富，并已經(jīng)成為現(xiàn)代免疫學(xué)的重要組成部分。分別從事佐劑研究，對(duì)于深入理解佐劑作用機(jī)理和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方式很有意義。

免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生較早、較強(qiáng)、持久的免疫應(yīng)答。理想的免疫佐劑應(yīng)該能滿足以下條件：（1）在有效劑量?jī)?nèi)無(wú)毒或毒性極小；（2）能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答；（3）具有持久的免疫力；（4）不誘導(dǎo)自身免疫；（5）無(wú)致突變、致癌、致畸形作用等。雖然現(xiàn)在已有許多佐劑應(yīng)用于動(dòng)物，但還沒(méi)有哪一種佐劑能完全滿足以上要求。

近年來(lái)，隨著第2、3代疫苗的迅速發(fā)展，特別是多肽疫苗呈現(xiàn)出的極大發(fā)展空間，促使免疫佐劑也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。

目前通過(guò)FDA批準(zhǔn)的能用于人的佐劑鋁膠佐劑存在兩方面主要缺點(diǎn)：其一，只能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。而細(xì)胞免疫對(duì)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)寄生病原體(病毒、原蟲(chóng)等)及腫瘤免疫力的產(chǎn)生尤為必要。其二，鋁膠佐劑對(duì)人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、單純皰疹病毒（HSV）、流感病毒，以及血吸蟲(chóng)病、百日咳和傷寒等抗原沒(méi)有免疫佐劑性效果。因此已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足新型疫苗發(fā)展的要求。

納米技術(shù)是一門具有廣闊前景的新興技術(shù)，納米技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物-納米佐劑已成為了當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)。從免疫學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細(xì)胞（M5）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的首選吞噬目標(biāo)，這為實(shí)現(xiàn)機(jī)體有效的免疫反應(yīng)完成了重要的一步。而且納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規(guī)佐劑載體效應(yīng)的發(fā)生，起到保護(hù)抗原的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷，提供新型DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒的免疫佐劑。

具體地，本發(fā)明一方面提供一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS3短發(fā)夾序列的重組質(zhì)粒，所述AS3短發(fā)夾序列為通過(guò)環(huán)狀序列連接的SEQ?NO.1所示序列與其互補(bǔ)序列。

所述殼聚糖增溶衍生物可以為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。

所述環(huán)狀序列可以為TCAAGAG序列。

所述重組質(zhì)粒的大小可以為4610bp。

所述納米顆粒的粒徑可以為35-50nm。

所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質(zhì)粒的的包被比例為摩爾比20:1。

本發(fā)明另一方面提供用于制備該納米顆粒的方法，包括以下步驟：

S1合成AS短發(fā)夾序列，并退火；

S2將經(jīng)退火的AS短發(fā)夾序列與雙酶切線性質(zhì)粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質(zhì)粒溶液；以及

S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒溶液。

步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH可以為5.5。

步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液在混合前，可以分別于65℃恒溫5分鐘。

本發(fā)明再一方面提供該納米顆粒作為免疫佐劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的納米顆粒免疫佐劑均勻性好；可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；細(xì)胞毒性小；可快速有效地降低細(xì)胞因子的表達(dá)；通過(guò)納米顆粒包括技術(shù)，在細(xì)胞中具有緩釋效應(yīng)，且能保護(hù)DNA免于被細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶降解。

【附圖說(shuō)明】

圖1示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的重組質(zhì)粒的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的納米顆粒的掃描電鏡圖像。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的納米顆粒的凝膠阻滯電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖4示出本發(fā)明的納米顆粒在降低細(xì)胞因子表達(dá)上的作用。

【具體實(shí)施方式】