[發明專利]一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物

有效

• 申請號: 201210572569.6
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN102978291A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 陳萬義;艾連中;任婧;穆海菠;杭鋒;郭本恒;李云飛
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物。

背景技術

克羅諾桿菌屬(Cronobacter?spp)是人和動物腸道內寄生的一種革蘭陰性無芽孢桿菌。作為一種重要的食源性條件致病菌，克羅諾桿菌屬菌株能夠引起嬰兒致命的感染，致死率高達10%-80%。它通常能導致嬰兒嚴重的臨床癥狀，例如腦膿瘍，腦膜炎，壞死性小腸結腸炎和全身性敗血癥。曾經有在嬰兒配方粉中分離到阪崎克羅諾桿菌菌株的報道。克羅諾桿菌屬菌株是通過配方粉危害嬰幼兒健康的重要條件性致病菌。新生嬰兒或早產兒都存在通過食用污染有克羅諾桿菌屬的嬰兒配方粉而感染克羅諾桿菌屬菌株的風險。在污染環節調查中發現,整個嬰幼兒配方粉生產工藝流程中,可檢測到克羅諾桿菌的污染點占到全部取樣點的31%。因此，對克羅諾桿菌屬菌株快速鑒定與鑒別是實現有效控制的基礎。該菌在1980年被首次命名和定義后,又于2008年由一個種被重新分為克羅諾桿菌新屬(Cronobacter?spp.),屬下分為5個新種(其中Cronobacter?sakazakii稱為新組合)、1個克羅諾桿菌基因種(Genomospeciese)和3個新亞種,盡管該菌的分類和名稱已變,但目前檢測仍然沿用程序式的阪崎腸桿菌標準檢測方法,以傳統生化反應進行鑒定,需要18-24h，而且無法區分為哪一種,這顯然已經不能滿足對克羅諾桿菌屬菌株檢測的需求。在鑒別方面,盡管已有擴增片段長度多態性分析(Amplified?fragment?length?polymorphismas,AFLP)、16S?rRNA全序列比較、DNA-DNA雜交實驗及多位點測序等多種可靠方法，但這些根據遺傳特征的分析方法耗時長、工作量大。因此，目前缺少對克羅諾桿菌屬菌株的高效率的鑒定與鑒別方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于克服現有傳統技術檢測時間長的缺陷，提供一種克羅諾桿菌屬菌株的PCR檢測方法、核酸及引物對。采用本發明的檢測方法檢測克羅諾桿菌屬菌株，檢測時間短，成本低，更加具有實用性，檢測結果特異，結果判定簡單。

本發明的技術方案如下：

本發明的技術方案之一是：一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法，包括以下步驟：

（1）提取待檢樣品的基因組DNA，以其為模板，以克羅諾桿菌屬特異性擴增引物對為引物，進行PCR擴增，所述的引物對中，一條引物的序列為SEQ?ID?NO.1所示，另一條引物的序列為SEQ?ID?NO.2所示；和

（2）檢測438bp位置單一擴增產物的存在。

根據本發明，步驟（1）中，所述PCR中，PCR的反應體系較佳的為：1×PCR反應緩沖液，10-15mmol/L?Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L?dNTP，0.1-0.3μM引物1，0.1-0.3μM引物2，Taq酶0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。更佳的為：1×PCR反應緩沖液，12.5mmol/L?Mg²⁺，0.25mmol/L?dNTP，0.2μM引物1（SEQ?ID?NO.1），0.2μM引物2（SEQ?ID?NO.2），Taq酶0.04U/μL，DNA模板50ng/μL。

步驟（1）中，所述PCR中，PCR的擴增程序較佳的為：92-95℃預變性3-6min，之后開始以下循環，每個循環的程序為：92-95℃變性20-40s，60-65℃退火20-40s，70-74℃延伸20-40s；循環共30-40個；循環結束后，70-74℃延伸8-12min，降溫至4-15℃，結束。更佳的為：94℃預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為：94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；循環共35個；循環結束后，72℃延伸10min，降溫至12℃，結束。

步驟（2）中，所述的檢測結果的判斷方法如下：在檢測的結果中，如果存在438bp位置的單一擴增產物，則說明待檢樣品中含有克羅諾桿菌菌屬菌株；如果不存在438bp位置的單一擴增產物，則待檢樣品中不含有克羅諾桿菌屬菌株。

步驟（2）中所述的檢測方法，可以是本領域常規的方法，優選的為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。

本發明的方法尤其適用于檢測食品中的克羅諾桿菌屬菌株，特別是奶粉中的克羅諾桿菌屬菌株的檢測。