[發明專利]一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物

有效

• 申請號: 201210572569.6
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN102978291A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 陳萬義;艾連中;任婧;穆海菠;杭鋒;郭本恒;李云飛
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待檢樣品的基因組DNA，以其為模板，以克羅諾桿菌屬特異性擴增引物對為引物，進行PCR擴增，所述的引物對中，一條引物的序列為SEQ?ID?NO.1所示，另一條引物的序列為SEQ?ID?NO.2所示；和

（2）檢測438bp位置單一擴增產物的存在。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述PCR中，PCR的反應體系為：1×PCR反應緩沖液，10-15mmol/L??Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L?dNTP，0.1-0.3μM引物1，0.1-0.3μM引物2，Taq酶0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述PCR中，PCR的反應體系為：1×PCR反應緩沖液，12.5mmol/L?Mg²⁺，0.25mmol/L?dNTP，0.2μM引物1，0.2μM引物2，Taq酶0.04U/μL，DNA模板40ng/μL。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述PCR中，PCR的擴增程序為：92-95℃預變性3-6min，之后開始以下循環，每個循環的程序為：92-95℃變性20-40s，60-65℃退火20-40s，70-74℃延伸20-40s；循環共30-40個；循環結束后，70-74℃延伸8-12min，降溫至4-15℃，結束。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述PCR中，PCR的擴增程序為：94℃預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為：94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；循環共35個；循環結束后，72℃延伸10min，降溫至12℃，結束。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中所述的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測法。

7.一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的試劑盒，其特征在于，其包括一條序列為SEQ?ID?NO.1所示的引物和一條序列為SEQ?ID?NO.2所示的引物。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括10×PCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl₂。

9.一種擴增克羅諾桿菌屬菌株的引物，其特征在于，其序列如SEQ?ID?NO.1所示或者如SEQ?ID?NO.2所示。