[發明專利]一種簡便的細菌基因敲除的方法

無效

• 申請號: 201210572241.4
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103898143A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;黨利君;金言
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體的是涉及一種簡便的細菌基因敲除的方法。

背景技術

同源重組作為體內基因工程的新方法使DNA修飾變得更容易、更有效，它是功能基因組分析的高效方法，可以在沒有限制性內切酶和DNA連接酶的情況下實現DNA修飾。

傳統同源重組方法是利用RecA重組系統，但是以RecA同源重組為基礎的基因敲除有很大的不足，如需要較長的靶基因同源臂，重組率很低，很難獲得所需要的重組子等。1998年，Murphy首次報道了利用λ噬菌體Red重組系統在大腸桿菌染色體上進行基因替換的方法，將λ噬菌體的重組功能基因exo，bet，gam在多拷貝質粒上表達，用于野生型E.coli宿主菌的基因替換。近年來，Red重組以其較短的同源臂和較高的重組效率等優點廣泛用于大腸桿菌的基因修飾中。Red同源重組由λ噬菌體的exo，bet，gam?3個基因組成，分別編碼Exo、Beta、Gam?3種蛋白質。Exo作為雙鏈核酸外切酶，可以結合在雙鏈DNA.的末端，從5′向3′降解DNA單鏈，產生3′末端單鏈懸突(3′single?strand?DNA?overhangs)。Beta作為單鏈退火蛋白，結合在由核酸外切酶(Exo)外切產生的3′末端單鏈懸突上，促進DNA互補鏈的退火。Gam蛋白作為Exo、Beta的輔助蛋白，可與RecBCD核酸外切酶結合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，抑制體內的外源DNA的降解。RecBCD是高度ATP依賴的雙鏈DNA核酸外切酶，在大腸桿菌中用于基因的同源重組和DNA復制叉的修復。研究表明，Gam蛋白對于反應進行中的RecBCD雙鏈DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事實上，Gam蛋白并不能抑制一個正在進行的反應，而是在ATP的存在下分離連在雙鏈DNA末端的RecBCD。

對于敲除細菌基因的Red重組系統共需要三種質粒：一種質粒是表達重組酶相關的Exo、Beta、Gam這3種蛋白質的輔助質粒；另一種質粒含有兩側帶有翻轉酶結合位點(flipase?recognition?target，FRT)的抗性基因，用作PCR模板；最后一種質粒是抗性基因消除質粒，其含有的重組酶能特異識別FRT位點，從而消除染色體上同源重組的抗性基因。對于整個基因敲除過程中，最重要的是控制同源所需的三個蛋白的表達。表達這三個蛋白的質粒如pKD46、pRedET。這兩個質粒均含有溫度敏感型復制起始點oriR101，在37℃培養時能夠正常復制，而高于37℃時會自動丟失。此外，pKD46上還含有ParaB啟動子調控的exo、bet、gam基因，它們通過L-阿拉伯糖誘導表達，并攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標記。而pRedET上調控exo、bet、gam基因的表達的啟動子則是P_BAD啟動子；同樣是通過L-阿拉伯糖誘導表達；但是P_BAD啟動子比ParaB啟動子的調控方式更嚴謹，P_BAD啟動子同時還受araC基因產物的正調控和負調控，araC作為轉錄阻遏物可以與L-阿拉伯糖形成復合物，從而啟動轉錄。

對于敲除細菌基因組中的靶基因目前常選用Red重組系統。不同的質粒上λ噬菌體的重組功能基因exo，bet，gam的表達調控方式不一樣。對于選用由L-阿拉伯糖誘導重組功能蛋白表達的質粒，敲除不同基因則需要摸索L-阿拉伯糖的誘導濃度，此過程耗時耗力。

發明內容

基于此，本發明提供一種簡便的細菌基因敲除的方法。

實現上述目的的技術方案如下。

一種細菌基因敲除的方法，包括以下步驟：(1)pSIM19轉化E.coli?O56得到含pSIM19的重組E.coli?O56；

(3)制備含pSIM19的E.coli?O56電感受態細胞：挑取重組E.coli?O56的陽性克隆，培養，菌體濃度OD₆₀₀為0.4-0.5時放入42℃水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預冷的無菌的EP管中；然后用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體四次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態細胞E.coli?O56/pSIM19；