[發明專利]一種簡便的細菌基因敲除的方法

無效

• 申請號: 201210572241.4
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103898143A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;黨利君;金言
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

1.一種細菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)pSIM19轉化E.coliO56，得到含pSIM19的重組E.coliO56；

(2)制備含pSIM19的E.coliO56電感受態細胞：挑取重組E.coli?O56的陽性克隆，培養，菌體濃度OD₆₀₀為0.4-0.5時放入42℃水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預冷的無菌的EP管中；然后用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體三至五次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態細胞E.coliO56/pSIM19；

(3)以質粒pKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態細胞重組菌E.coli?O56/pSIM19中加入所述帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養基，37±0.5℃，培養1.5±0.2h后，離心后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培養，長出單菌落，將單菌落劃線于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，長出較濃菌苔，篩選得到目的基因已經被消除的陽性重組子。

2.根據權利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述pSIM19轉化E.coli?O56的步驟為：將質粒加入到E.coliO56感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴；42℃水浴熱激90±2s，迅速轉移至冰上，繼續冰浴2±1min；無菌條件下，加入LB培養基，37±0.5℃，100±10rpm慢搖，恢復培養1±0.2h；離心培養物后取適量培養物涂布含100±2g/mL?Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養基吸收后，將平板倒置，37±0.5℃恒溫培養，12-16h，得到含pSIM19的重組E.coliO?56。

3.根據權利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(2)中用預冷的無菌超純水水洗EP管中菌體時，每次在12000±20rpm，4±1℃的條件下離心1±0.1min以除去超純水。

4.根據權利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述無菌超純水是MiliQ超純水。

5.根據權利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(3)中PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段的擴增引物為SEQ?IDNO.1和SEQ?ID?NO.2。

6.根據權利要求1-5任一項所述的細菌基因敲除的方法所制備得到的目的基因wfaQ被敲除的陽性重組子E.coliO56。