[發明專利]一組特異性識別無乳鏈球菌的寡核苷酸適配子

有效

• 申請號: 201210570202.0
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103014000A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 王周平;王鑫;段諾;吳世嘉;夏雨;馬小媛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;C12Q1/14;C12R1/46
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)制備一種與無乳鏈球菌高特異性和高親和力結合的核酸適配子，為該核酸適配子在檢測無乳鏈球菌中的應用提供科學依據和理論基礎。

背景技術

無乳鏈球菌(Streptococcus?agalactiae)又稱B族鏈球菌(Group?B?of?streptococcus，GBS)，不僅可引起奶牛乳房炎，使得奶牛產奶量下降，乳汁質量下降，給奶業造成巨大的經濟損失；同時，也是引起人類新生兒和妊娠婦女發病及死亡的最重要感染性病原菌。Boe研究報道，美國每年因GBS感染導致1300多名產婦死亡，Heath等研究報道，英國新生兒GBS感染的發病率為0.72/1000活產嬰兒。因此，如何快速、準確檢測無乳鏈球菌具有重要研究意義。

傳統檢測病原菌的方法往往是需要先分離病原微生物，然后通過微生物培養，再用經典的方法鑒定。耗時、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。因此發展快速、靈敏檢測病原微生物的技術十分必要。利用抗體雖然能夠特異識別病原細菌，能夠迅速、準確的對待檢標本作出鑒定，但該技術受特異性抗體制備難度的制約。因為按照伯杰分類標準，生物學形狀基本相同的細菌群體構成一個菌種，性狀相近關系密切的若干菌種組成一個菌屬。從本質上講，同一菌屬所含的表面抗原絕大多數是相同的，只有細微的差別，找到這些差別并制備相應特異性抗體顯然是一項耗時而艱巨的任務。

近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過SELEX過程篩選的與靶物質特異性結合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技術(Systematic?Evolution?ofLigands?by?Exponential?Enrichment，系統進化指數富集技術)是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學技術，是一種研究核酸結構和功能的有效方法。其基本原理是體外化學合成一個隨機單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質混合，形成靶物質-核酸復合物，洗去未與靶物質結合的核酸分子，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下輪的篩選過程。通過數輪重復篩選與擴增，最后得到高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術篩選獲得的aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，適配子具有更明顯的優越性，如不依賴動物細胞，不受免疫條件和免疫原性限制，適配子的篩選完全在體外進行，具有時間、質量和數量上的選擇彈性，可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子；適配子變性與復性可逆且速度快，可反復使用、長期保存和室溫運輸；靶分子范圍更廣，除蛋白質、核苷酸大分子外，還有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶堿等)、生長因子、肽鏈、類固醇、糖類、輔因子(如FMN等)，甚至可用于完整的細胞、病毒、孢子等；與靶分子結合具有更強的特異性和親和力，不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾，可以在靶目標性質未知的情況下篩選出其相應的適配子；適配子通過占據靶物質表位，使疾病得到控制，作為臨床藥物的治療，已顯現了潛在的應用前景，已有研究通過SELEX技術篩選到相應靶物質的適配子作為拮抗劑，抑制腫瘤生長時的血管內皮生長因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用，以達到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對一些致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內部結構、功能及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX過程篩選到與其對應的適配子，檢測靶物質，已成為該領域的研究探索熱點。

本發明以臨床上及奶牛業中常見的無乳鏈球菌為靶標，利用SELEX技術獲得了與無乳鏈球菌特異性結合的核酸適配子序列，該序列可以快速、準確檢測無乳鏈球菌，由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩定、合成方便且廉價、經修飾后可直接用于熒光或化學發光、發色方法檢測靶細菌，因此操作簡單、直接。該發明可以在生物、食品、醫學等領域得到廣泛應用。

發明內容

本發明目的在于提供一種微生物分子生物學檢測方法，特別涉及一種利用適配子技術快速、準確檢測無乳鏈球菌的方法。

本發明方法利用指數級富集配體的系統進化技術(SELEX技術)，以無乳鏈球菌完整的菌細胞為靶標，篩選獲得與靶細胞高親和性、高特異結合的適配子，通過羧基熒光素(FAM)標記方法將獲得的適配子轉為報告適配子，用于從臨床血、食品培養上清中檢測到相應的靶細菌，達到快速、準確診斷的目的。

本發明的優點：