[發明專利]一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND4基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法

無效

• 申請號: 201210563401.9
• 申請日: 2012-12-22
• 公開（公告）號: CN103409497A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 程雙懷;張逸;夏夢寧;劉應龍;盧燕梅;閆錦錦;張寧
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 梁李兵

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND4?基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法。?

背景技術

早期的輪蟲分類學和系統學研究主要是依據形態學數據。如Wallace（1989）利用八種形態學特征進行聚類分析研究發現輪蟲門（Rotifera）、真輪蟲總綱（Eutatoria）和單巢綱（Monogonota）為單系，利用九種形態學特征進行聚類分析研究發現葉輪屬（Notholca）分為六個分支。Melone（1998）通過對1種棘頭動物、6種輪蟲和2個外群（渦蟲和顎胃動物）的60個形態特征進行矩陣分析，獲得一個簡約聚類樹，發現雙巢綱（Digononta）為并系類群，但不能確定輪蟲門的單系性。該系統樹不同于依據分子水平數據或演化分類原理而產生的系統樹。以形態學數據所研究的輪蟲系統學存在缺陷，因為輪蟲的形態受遺傳和環境因子兩方面的影響，盡管遺傳因素占主導地位。隨著輪蟲研究的深入，已有研究者發現形態學數據已經不能滿足輪蟲部分種類鑒別和系統進化研究（Guiset，1977；Koste，1978；Shiel，1993；Fontaneto，2007）。Sergi(2005)等研究了褶皺臂尾輪蟲(B.?plicatilis)L-型的兩個種B.?plicatilis?sensu?stricto?和B.?manjavacas之間的形態度量差異，發現B.?plicatilis?s.s.比B.?manjavacas平均長6％，兩個種的個體之間表現出較大的形態度量交迭，形態學分類不能用于鑒別這兩個種，目前它們的分類只能依據分子指標。2003年，為了了解形態可塑性和基因變異在輪蟲的形態變化中的作用，Derry等研究了不同形態的龜甲輪蟲(Keratella)線粒體COⅠ基因序列，發現有棘刺和無棘刺的螺形龜甲輪蟲(Keratella?cochlearis)遺傳變異較大，核酸序列的差異達到4.4％，暗示它們是不同的種。而單棘刺和雙棘刺的曲腿龜甲輪蟲(K.?hiemalis)核酸序列的差異為0.21％，并且氨基酸序列沒有變異，說明它們的形態變異歸因于環境的誘導。?

傳統的輪蟲分類主要依據頭冠、棘刺、足和口器等外部形態和內部結構等形態學特征。但由于輪蟲種類眾多、體型微小及表型可塑性，輪蟲外部形態有些物種非常相似，并且同一物種還有季節性的周期變形，且許多種類缺乏有效地形態學分類特征，僅通過傳統的方法進行鑒定和分類存在一定的困難，如壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲均為臂尾輪屬常見種類，因它們具有相似的形態，早期的研究曾將這兩種輪蟲歸為一種，稱為Brachionus?urceus，也譯為壺狀臂尾輪蟲（張家楫）；后來Koste、章宗涉和黃祥飛等根據蟲體前端棘刺的兩側是否對稱?和眼點的形狀把B.urceus分為B.urceolaris和B.rubens兩種，因此種的界定標準仍存在模糊不清之處，因此傳統鑒定方法滿足不了鑒定要求，并且內部咀嚼器的超微結構需要電子顯微鏡的輔助，鑒定困難。?

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND4?基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，本鑒定方法使用實驗所設計的引物擴增輪蟲線粒體上ND4?DNA序列，并對PCR產物進行純化、連接、克隆、轉化、測序，將序列進行比對分析來鑒別輪蟲的種類。對輪蟲進行分子生物學的種類鑒定，解決了利用形態學和超微結構存在的鑒定困難，使得在大規模培養輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競爭而造成輪蟲減產甚至大量死亡的可能性。?

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：?

一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND4基因的部分DNA測序方法，包括以下步驟：?

A、臂尾輪屬輪蟲總DNA提取；?

B、PCR引物擴增及序列測定；?

C、系統發生分析。?

所述步驟B中PCR引物為：ND4W1:?5’-CCTA(TAG)GGCTCATGTTGAGGC-3’和ND5W2:?5’-ACAAGGGT(AG)GAAGAATGAAC-3’；?

擴增反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s,?48℃退火50s,?68℃延伸3min,?共15個循環；95℃預變性5min；95℃變性30s,?48℃退火50s,?68℃延伸3min,?延伸時間每個循環加5s，共15個循環；最后72℃延伸10min,?4℃保存。?