[發明專利]凹凸棒土負載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法

無效

• 申請號: 201210561348.9
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103045581A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 賈建波
• 申請（專利權）人: 淮陰工學院
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

技術領域

????本發明屬于微生物活性保護研究領域，具體地，涉及一種凹凸棒土負載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法。

背景技術

微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。橙色粘球菌是土壤中分離得到的粘細菌之一，多用于原核生物社會學行為研究的模式菌，其保存方法主要有傳代培養保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、載體保藏法、冷凍保藏法、冷凍干燥保藏法等，各種保藏方法都有其缺點，如耗時、耗材、設備費用昂貴等。

固定化微生物技術是在固定化酶技術的基礎上發展起來的一項新的生物技術，采用物理或化學方法將微生物限定在一定的空間內，從而保持微生物活性。通常采用的固定化微生物技術主要有吸附法、載體結合法、交聯法和包埋法等。

有多篇文獻及專利報道采用固定化保藏菌種，例如文獻“光合細菌G3菌株固定化保存方法的研究，安徽農業科學，2011,39（2）：676-678”，申請號為200710018010.8的專利“基于固定化細胞技術的菌種保藏方法”?等都報道了采用固定化細胞技術進行菌種保藏的方法。尚未檢索到凹凸棒土負載殼聚糖對橙色粘球菌細胞固定化的報道。

載體材料的性能對固定化微生物功能的發揮起著至關重要的作用。通常載體的表面粗糙度與電荷是影響固定化速率的重要因素，載體材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面附著固定，同時孔洞和縫隙等的存在對已吸附的微生物具有保護的作用，使它們免受水力剪切的影響。

凹凸棒土是一種多孔型鏈層狀含水富鎂鋁硅酸鹽類粘土礦物，晶體結構內部沸石通道的存在賦予了凹凸棒土巨大的內表面積，表面豐富的Si-OH?基團對有機質具有很強的親和力，可直接或通過適當的改性處理用于固載催化劑，改性凹凸棒土作為生物催化劑酶的載體，在固定化酶的技術中被廣泛使用。

發明內容

本發明的目的是：提供一種凹凸棒土負載殼聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，利用凹凸棒土負載殼聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制劑生產成本，提高活菌存活率，操作方便，可適用于粗放的工業化大生產。

本發明的技術解決方案是：以凹凸棒土為原料，對凹凸棒土進行改性處理后負載殼聚糖，再采用包埋、吸附法相結合對橙色粘球菌進行固定化。

其中，凹凸棒土負載殼聚糖包被橙色粘球菌固定化方法包括以下步驟：

（1）凹土純化：凹土與去離子水混合，凹土與去離子的比例為1:5（w/v），常溫下100r/min攪拌24h，靜置沉降24h后倒掉最下層雜質和上清液，加入與上清液等量的去離子水，再常溫100r/min攪拌24h，靜置24h倒掉上清液和下層雜質，抽濾，105℃烘干，得純化凹土；

（2）凹土改性：取純化凹土，加入體積濃度為60%的硫酸溶液，凹土與60%的硫酸溶液的比例為1:5（w/v），常溫下以100r/min的轉速攪拌24h，抽濾，水洗濾餅至水為中性，濾餅105℃烘干，得改性凹土；

（3）凹凸棒土負載殼聚糖：用3%(v/v)的醋酸水溶液緩慢溶解脫乙酰度為90%的殼聚糖，配置濃度為5%（w/v）的殼聚糖溶液；取改性凹土加入濃度為5%（w/v）的殼聚糖溶液中，改性凹土與殼聚糖的質量比為1:0.3，50℃攪拌6?h，靜置6?h后除去上清液，抽濾，濾餅115℃干燥，冷卻，研細，過160目篩，得凹凸棒土負載殼聚糖的固體吸附劑；

（4）菌株活化：取一株橙色粘球菌(Myxococcus?fulvus)?JCH-04，保藏號為CGMCC?No.?2893，菌株在CY培養基上34℃培養1天，在發酵培養基中34℃、150rpm搖瓶培養2天，接種量為10⁶CFU/ml；該菌株16S?rDNA的GenBank登錄號為FJ826620；所述的CY培養基組成為：每1000ml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，牛血白蛋白0.5g，泛酸鈣0.5g，pH7.5；?所述的發酵培養基組成為：每1000mL水中含有可溶性淀粉8g?，黃豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.25g?,?CaCl₂?1g，?MgSO_4·7H₂O?0.5g，?pH?7.5；