[發明專利]一種Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697）的檢測方法

有效

• 申請號: 201210559154.5
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN102978290A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 張和平;張家超;陳永福
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/245
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

1.一種定性定量檢測L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的方法，包括如下步驟：（1）從檢測樣品中提取DNA,制備用于進一步擴增的模板DNA；（2）PCR擴增，以L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的全基因組序列為依據，設計如下引物序列：LcZ?F:tgagccgctatctgatagtctt；LcZ?R:ccgacgtaccagctcact，利用設計的引物通過PCR擴增模板DNA；（3）通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測PCR擴增產物，定性檢測樣品中的L.casei?Zhang（CGMCC?1697）；（4）通過q-PCR檢測樣品中L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的數量。

2.權利要求1所述的一種定性定量檢測L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）從檢測樣品中提取DNA,制備用于進一步擴增的模板DNA

采用液氮凍融-CTAB法：取1.0g樣品洗滌處理，將洗脫的菌體于1.5mL離心管中，立即置于液氮中完全凍結，取出后放入65℃水浴中融化5min，反復凍融3次，加0.1mL?10%SDS和10.0μL?10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒溫搖床中200r/min搖動2h，室溫下12000g離心10min，收集上清液轉移至另一離心管中，上清液與等體積的氯仿于12000g離心10min，吸取上清液轉移至另一離心管中進行酚氯仿抽提2次，經0.1倍體積的醋酸鈉，1倍體積的冰異丙醇沉淀總DNA，然后70%乙醇洗滌沉淀2次，回溶備用；

（2）PCR擴增L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的特異性片段

擴增引物具體序列為；

LcZ?F:tgagccgctatctgatagtctt；LcZ?R:ccgacgtaccagctcact;

擴增體系：

反應體系50μL：10×PCR?Buffer?5μL，25mmo1/L?Mg²⁺?1.0μL，2.5mmol/L?dNTPs?4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL?Taq酶0.5uL，dd?H₂O補足至50μL；

擴增條件：

95℃變性5min；循環30次：95℃變性1min，65℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存。

（3）瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測

將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min，EB染色，紫外拍照，檢測擴增效果；其中設置以含有目的擴增片段的質粒DNA作為模板的陽性對照，以滅菌水作為模板的陰性對照，根據在336bp處是否出現預期性特征條帶，定性確定樣品中是否含有L.casei?Zhang（CGMCC?1697）；

（4）Q-PCR檢測樣品中L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的數量

首先應用已知數量的L.casei?Zhang（CGMCC?1697）通過Q-PCR擴增制作標準曲線，然后以標準曲線為依據，用上述特異性引物定量檢測樣品中L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的數量；

Q-PCR擴增體系：

反應體系20μL：10×PCR?mix?10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd?H₂O補足至20μL；

Q-PCR擴增條件：

95℃變性20s；循環40次：95℃變性5s，65℃退火30s，72℃延伸35s。

3.權利要求1或2所述的一種定性定量檢測L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的方法，其特征在于檢測樣品是發酵的酸奶樣品，或服用Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）發酵酸奶樣品的志愿者糞便。

4.一種用于權利要求1所述的檢測方法的特異性引物，引物序列如下：LcZ?F:tgagccgctatctgatagtctt；LcZ?R:ccgacgtaccagctcact。