[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發(fā)酵方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210559100.9
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103013844A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設計）人: 劉順啟;王興吉;李方方;劉文龍
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N9/62;C12R1/69
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉突變株及其液體發(fā)酵技術，屬于生物工程技術領域。

背景技術

中性蛋白酶作用條件溫和，是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑，可廣泛應用于食品、飼料、制藥等行業(yè)，現(xiàn)在市場上多是由細菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶，還未發(fā)現(xiàn)有通過液體發(fā)酵米曲霉來生產(chǎn)中性蛋白酶的方法。米曲霉液體發(fā)酵具有酶系豐富、發(fā)酵容易控制、發(fā)酵后提取工藝簡單等優(yōu)點，因此受到越來越多的關注，米曲霉液體發(fā)酵受其表型的影響，產(chǎn)孢子的菌株進行液體發(fā)酵時往往會出現(xiàn)菌絲結團、發(fā)酵料液粘稠等不利現(xiàn)象，進一步影響發(fā)酵活力。所以，選育高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株，表型適合液體發(fā)酵，可進行大規(guī)模生產(chǎn)中性蛋白酶是非常有意義的任務。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一株適于液體發(fā)酵高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發(fā)酵生產(chǎn)方法。

本發(fā)明提供一種米曲霉(Aspergillus?oryzae)菌種，該菌株已經(jīng)于2012年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，(郵編100101)，保藏編號為CGMCC?No6848。

所述米曲霉突變菌株CGMCC6848采用米曲霉M321和米曲霉J5進行多輪原生質體電融合育種選育獲得。米曲霉M321在麩皮豆粕固體培養(yǎng)基中發(fā)酵酶活最高15000u/g，液體發(fā)酵中性蛋白酶最高450u/ml，米曲霉J5固體發(fā)酵產(chǎn)酶最高活力為8000u/g，液體發(fā)酵最高酶活為10000u/ml，突變株CGMCC6848液體發(fā)酵酶活達到20000u/ml，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，液體發(fā)酵平均產(chǎn)酶活力在25000u/ml。

米曲霉M321是經(jīng)紫外誘變篩選到的高產(chǎn)中性蛋白酶菌株，其液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力極低，不到500u/ml，米曲霉J5生長表型為菌絲型不產(chǎn)孢子，液體培養(yǎng)其菌絲短細，發(fā)酵液混合均勻，物料、溶氧傳遞效果良好，為了得到一株適合液體發(fā)酵的高產(chǎn)中性蛋白酶菌株，對兩株菌先進行紫外滅活后再進行多輪電融合選育，直到選育出一株低產(chǎn)孢子、高產(chǎn)蛋白酶的菌株。

所述米曲霉菌株所產(chǎn)中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。

米曲霉突變菌株CGMCC6848液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的的方法，包括如下步驟：

種子培養(yǎng)：菌株進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)基配方為淀粉3-10％，大豆蛋白2-5％，麩皮0.2-0.5％，硝酸鈉0.2-0.5％，磷酸二氫鉀0.2-0.5％，玉米漿0.5-2％。培養(yǎng)溫度31-33℃，培養(yǎng)時間50-70小時。

液體發(fā)酵：在50L發(fā)酵罐進行液體發(fā)酵實驗，接種量10-15％，發(fā)酵過程補料控制pH在6.0-6.5，培養(yǎng)溫度30-32℃，罐壓0.07MPa，風量0.2-1.5vvm，培養(yǎng)周期100-120小時。

中性蛋白酶的提取與精制：發(fā)酵結束后，按發(fā)酵液體積加入40％的水和0.3％氯化鈣，加入3％珍珠巖助濾劑，進行壓濾，濾液經(jīng)超濾濃縮后可進行酒精溶析得到固體酶制劑，也可將濃縮液加入穩(wěn)定劑(金屬離子)得到液體酶制劑。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：淀粉5-10％，大豆蛋白3-6％，麩皮1-3％，硝酸鈉0.3-1％，磷酸二氫鉀0.2-0.8％，玉米漿1-2％，補料配方為：淀粉10-20％，豆餅粉4-8％，硫酸銨0.2-0.5％，玉米漿0.8-1.5％。

有益效果

本發(fā)明通過對原始菌株進行誘變提高酶活后，對兩株不同表型的米曲霉進行原生質體融合篩選，再經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了液體發(fā)酵中性蛋白酶的方法，發(fā)酵活力在2.5萬u/ml，生產(chǎn)的中性蛋白酶在40℃保溫1h后剩余酶活為91％，具有良好的耐熱性，可廣泛應用于食品、飼料、紡織等行業(yè)。

附圖說明：

圖1不同pH下的相對酶活

圖2不同溫度下的相對酶活

具體實施方式：

以下通過具體實施例對本發(fā)明做更詳細的說明，具體實施案例僅為舉例說明，不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。

菌株的選育：

1原生質體的制備

取兩株出發(fā)菌株的新鮮斜面，用無菌水洗脫菌體，在有玻璃珠的試管振蕩使菌體分散，離心收集菌體，用0.6M山梨醇滲透壓穩(wěn)定劑(0.1M檸檬酸緩沖液+0.6M山梨醇+0.01M?EDTA)懸浮，離心洗滌后收集用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮，置冰中備用。然后加入溶菌酶1.2％、蝸牛酶0.8％、纖維素酶0.8％，在32℃進行酶解6小時，制得原生質體備用，其中原生質體制備率和再生率的計算方法如下：