[發(fā)明專利]檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210557526.0
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103018463A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉艷榮;王亞哲;常艷;郝樂;黃曉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577
• 代理公司: 石家莊眾志華清知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(特殊普通合伙) 13123
• 代理人: 王苑祥

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明屬于細(xì)胞表型確認(rèn)過程中的專用試劑盒，具體涉及一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著治療策略的改進(jìn)和新的化療藥物不斷出現(xiàn)，急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute?lymphoblastic?leukemia，ALL）的緩解率和生存率有了很大的提高，但是仍有一部分患者預(yù)后較差，最終死于復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后即使采用強(qiáng)化療、甚至造血干細(xì)胞移植，仍然難以挽回患者的生命，給社會(huì)和家庭都造成了極其沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究證明，治療后微量殘留病（MRD）的水平是復(fù)發(fā)的根源。

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow?cytometry，?FCM）是MRD檢測的常用方法之一，該方法是根據(jù)患者發(fā)病時(shí)的免疫標(biāo)志，確定該患者白血病細(xì)胞的特異性標(biāo)志，亦稱為白血病相關(guān)免疫表型（LAIP），通過對LAIP的識(shí)別來檢測MRD。

目前，國內(nèi)外的文獻(xiàn)主要采用三色或四色的抗體組合來檢測LAIP，不同的研究機(jī)構(gòu)采用不同的抗體組合，抗體選擇多樣化、分析時(shí)設(shè)門的方法也不一致。例如，歐洲主要報(bào)道了5組三色的抗體組合，共應(yīng)用15個(gè)抗體；美國St.jude兒童研究醫(yī)院則利用多組四色抗體組合。

為了提高檢測的靈敏度，三色FCM或四色FCM常常需要多組抗體組合，每組抗體組合中均有相同的抗體，這樣一方面增加了抗體總數(shù)目，進(jìn)而增加了試驗(yàn)成本和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；另一方面多組抗體組合需要在多管中分別檢測，影響了對檢測抗體的多參數(shù)分析：在分析LAIP時(shí)，有時(shí)需要多個(gè)標(biāo)志設(shè)門來限定一群細(xì)胞，例如第一管抗體組合中發(fā)現(xiàn)一群可疑LAIP陽性細(xì)胞，表型為CD45⁺CD19⁺CD10⁺CD34^-，但此群細(xì)胞數(shù)較低（＜10^-4），此時(shí)往往需要觀察此群細(xì)胞中其他抗原是否表達(dá)異常，以確定是否存在LAIP；但四色組合無法同時(shí)檢測第4種以外的抗體，從而影響了檢測的準(zhǔn)確性；若要觀察此群細(xì)胞的第五種或其他的抗原表達(dá)是否有異常，利用四色FCM則無法完成。為了提高LAIP檢測的靈敏度，需要能夠同時(shí)檢測多個(gè)熒光參數(shù)的FCM、以及設(shè)計(jì)合適的更多熒光參數(shù)的抗體組合。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒采用七種熒光標(biāo)記的抗體組合，利用該劑盒、并借助七色流式細(xì)胞儀的輔助，可快速準(zhǔn)確地分析LAIP的種類、性質(zhì)及判斷LAIP陽性細(xì)胞水平，對預(yù)后判斷和臨床治療方案的制定具有重要的指導(dǎo)意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，與七色流式細(xì)胞儀組成白血病相關(guān)免疫表型分類裝備，該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑組合：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45。

優(yōu)選的，所述單克隆抗體試劑組合CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45依前后排列順序依次進(jìn)行特異性熒光素標(biāo)記為：FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和Pacific?Blue。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

借助于上述的試劑盒和七色流式細(xì)胞儀對急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型進(jìn)行分析的方法，包括下述步驟：

步驟一、試劑配制

1.1、配制pH為7.2~7.4的10×PBS緩沖液，并稀釋10倍成為1×PBS緩沖液，

1.2、取溶紅細(xì)胞液，并用1×PBS緩沖液稀釋10倍，

1.3、取小牛血清加入至1×PBS緩沖液中，制備含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS；

步驟二、對骨髓標(biāo)本進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備測試標(biāo)本

2.1在同一專用試管中，依次分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體如下：3μLCD58-FITC、10μLCD10-PE、1μL?CD34-PerCP-CY5.5、1μLCD123-PE-CY7、2μL?CD38-APC、5μL?CD19-APC-Cy7和1.3μL?CD45-Pacific?Blue，然后再加入100μL骨髓標(biāo)本，混勻，室溫避光放置15分鐘孵育，

2.2、加入步驟1.2中稀釋后的溶紅細(xì)胞液2mL，混勻后避光，室溫放置?8分鐘，溶解紅細(xì)胞，