[發明專利]卡培立肽的制備方法

有效

• 申請號: 201210556840.7
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103880946A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 張文治;劉建;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/58
• 分類號: C07K14/58;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明涉及一種多肽的制備方法，具體地涉及卡培立肽的制備方法。

背景技術

卡培立肽（Carperitide），別名基因重組心房肽、卡哌利丁、Hamp、人腦利鈉肽，它的適應癥是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。卡培立肽藥理學作用是通過刺激心肌伸展，由心室內顆粒合成的，然后通過冠狀動脈分布全身，作用于血管平滑肌和腎臟等組織，調節血壓和體內電解質平衡。卡培立肽為28個氨基酸組成的一種循環調節激素，起血管擴張和利尿作用。卡培立肽引起的血管舒張是由于與血管平滑肌的ANP(心房利鈉多肽)受體結合，通過提高鳥苷酸環化酶的活性而實現的，提示可減輕心臟前、后負荷。

目前卡培立肽的合成方法分為兩大類：一是基因重組，二是采用Boc路線液相或固相合成。ZL200510012425.5公開了采用基因重組技術生產卡培立肽的方法，CN102382188報道了一種采用固相Fmoc路線逐個偶聯制備卡培立肽的方法，CA1245635A1報道的為采用Boc路線固相合成卡培立肽最后通過HF樹脂切割、液相氧化、HPLC（高壓液相色譜）純化等步驟得到精肽，CA1245637A1報道的為采用基因重組技術生產卡培立肽，其它的專利文獻如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重組技術生產卡培立肽或者采用Boc路線固相或液相方法合成得到精肽。采用基因重組技術，操作繁瑣，投資大，藥物純度不高，存在較高的技術壁壘。采用Boc路線液相或固相合成，需要使用HF及大量使用TFA，由此帶來對環境的嚴重污染。同時液相法存在操作周期長、操作繁瑣等缺點，不利于大規模工業化生產。而采用固相Fmoc路線逐個偶聯制備卡培立肽具有合成周期長、產率低的缺點。

為了克服上述缺點，本發明采用Fmoc路線固液結合片段法合成卡培立肽，具有操作簡單、合成周期短、對環境友好的特點。

發明內容

本發明提出了一種采用Fmoc路線固液結合片段法合成卡培立肽的方法，申請人發現，采用該方法，多個片段合成同時進行，合成周期減少了2/3，中間體易純化，成本低，最終產品純度高，副產物少，產品收率高，利于卡培立肽的大規模生產。在一個實施方案中實驗得到的粗肽純度為70%以上，總收率達到20%以上。

本發明所述卡培立肽的序列為：

H-Ser¹-Leu²-Arg³-Arg⁴-Ser⁵-Ser⁶-Cys⁷-Phe⁸-Gly⁹-Gly¹⁰-Arg¹¹-Met¹²–Asp¹³-Arg¹⁴-IIe¹⁵-Gly¹⁶-Ala¹⁷-Gln¹⁸-Ser¹⁹-Gly²⁰-Leu²¹-Gly²²-Cys²³-Asn²⁴-Ser²⁵-Phe²⁶-Arg²⁷-Tyr²⁸-OH(S-S:7-23)

具體地，本發明所述方法包括如下步驟：

1）在固相載體上采用固相Fmoc路線分別合成3個側鏈全保護肽樹脂A’、B’和C’，然后將其裂解得到3個側鏈全保護肽片段A、B和C，其氨基酸序列分別為，

片段A（1-9）：

Boc-Ser(tBu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly，

片段B（10-16）：

Fmoc-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-OH，

片段C（17-22）：Fmoc-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-OH，和在固相載體上采用固相Fmoc路線合成肽樹脂片段D，其氨基酸序列為D（23-28）：

Fmoc-Cys(trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tBu)-Resin；