[發(fā)明專利]牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210554970.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103014049A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張明;賴松家
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K14/555;C07K1/22;C12Q1/02
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• 代理人: 暫無(wú)信息

1.牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于它的克隆和重組載體構(gòu)建為：通過(guò)生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得牛IFN-τ成熟蛋白的CDS，以pMD18-T為克隆載體，在E.coli?JM109菌株中進(jìn)行其CDS的分子克隆，并測(cè)序；以pET28a+作為表達(dá)載體，在E.coli?BL21(DE3)工程菌株中進(jìn)行帶組氨酸標(biāo)簽的bIFN-τ蛋白的融合表達(dá)；運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的基本性質(zhì)、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、激酶作用位點(diǎn)、疏水性、二硫鍵位置、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步分析了bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白的差異；采用固相金屬離子親和層析技術(shù)，對(duì)bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，建立了一套完整的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物純化方法；最后以牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為研究模型，模擬在體水平的激素濃度，研究了bIFN-τ作用下，對(duì)牛子宮內(nèi)膜上妊娠識(shí)別相關(guān)基因表達(dá)的影響。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的采用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了bIFN-τ成熟蛋白的CDS，并構(gòu)建了bIFN-τ成熟蛋白的CDS的克隆載體，其步驟為：

(1)、采用通用的酚-氯仿法從牛全血中提取基因組DNA；

(2)、采用特異的引物對(duì)牛bIFN-τ成熟蛋白CDS進(jìn)行擴(kuò)增，并在擴(kuò)增同時(shí)在引物上設(shè)計(jì)Nde?I和BamH?I酶切位點(diǎn)，引物為：

Forward：5’-CAT?ATG?TGT?TAC?CTG?TCT?GAG?GAC?CAC-3’

Reverse：5’-GGA?TCC?TTA?TCA?AAG?TGA?GTT?CAG?ATC?TCC-3’

PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq?PCR?MasterMis?25.0μL，上下游引物各2μL，DNA模版2μL，加水至50μL；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min；

(3)、克隆載體構(gòu)建和測(cè)序：PCR產(chǎn)物為534bp，通過(guò)離心柱型DNA回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T載體鏈接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG瓊脂糖平板篩選陽(yáng)性克隆。白色的陽(yáng)性菌落再次在LB中培養(yǎng)后，通過(guò)酶切、PCR擴(kuò)增和測(cè)序方法對(duì)陽(yáng)性克隆載體進(jìn)行鑒定，獲得pMD18-bIFN-τ克隆質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的bIFN-τ表達(dá)載體構(gòu)建和誘導(dǎo)條件為：

(1)用質(zhì)粒提取試劑從陽(yáng)性E.coli?JM109菌中提取克隆質(zhì)粒pMD18-bIFN-τ，然后分別用Nde?I和BamH?I對(duì)pMD18-bIFN-τ、pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳后回收目的產(chǎn)物；然后利用T4DNA連接酶在16℃下20h，進(jìn)行目的基因與表達(dá)載體間的連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli?BL21(DE3)，用Kan/LB瓊脂糖平板篩選白色重組體菌落，將白色菌斑采用PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。

(2)、將鑒定的陽(yáng)性重組菌接種于3ml?Kan/LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖菌培養(yǎng)過(guò)夜；吸取菌液按1∶100的比例接種于50mlKan/LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖菌培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～1.0；加入IPTG，使終濃度為1.0mmol/L，于37℃，250r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，可獲得最大表達(dá)量的重組蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的純化和生物活性鑒定為：

(1)bIFN-τ的純化：誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體；包涵體用8M脲變性緩沖液溶解后，用HisTrap?HP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。用400mM的咪唑洗，在該條件下bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26.36％。柱上復(fù)性用1.5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrapDesalting脫鹽后，bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm降低到4mS/cm。

(2)生物活性鑒定：將純化的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物，以中濃度100ng/mL的濃度添加到無(wú)血清培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，與未添加bIFN-τ的對(duì)照組相比，如果添加bIFN-τ的子宮內(nèi)膜細(xì)胞上OXTR、ER-α和ER-β的表達(dá)水平顯著降低，表明bIFN-τ抑制了OXTR、ER-α和ER-β的表達(dá)，這與bIFN-τ在體的生物學(xué)功能一致，反映重組表達(dá)獲得的bIFN-τ具有生物活性。