[發(fā)明專利]一種極耐熱β-甘露糖苷酶基因及其表達(dá)蛋白與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210553323.4
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN102978222A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王飛;時(shí)號;黃穎娟;李迅;鄧若冰
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/11;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/01
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物質(zhì)利用領(lǐng)域，具體涉及一種極耐β-甘露糖苷酶基因及其表達(dá)蛋白與應(yīng)用。

背景技術(shù)

聚葡萄甘露糖類是除聚木糖類植物多糖外的另一重要的半纖維素。廣泛存在于椰子、魔芋粉、海藻及針葉材等植物體中。甘露聚糖酶和甘露糖苷酶是聚葡萄甘露糖半纖維素酶系中的最為關(guān)鍵的水解酶，前者通過隨機(jī)切割甘露聚糖的β-1,4-糖苷鍵，將甘露聚糖水解為甘露寡糖，后者再將甘露寡糖或一定聚合度的甘露聚糖降解為甘露糖甘露糖，是一種重要的糖質(zhì)營養(yǎng)素，廣泛分布于體液和組織中，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增加傷口愈合、抗發(fā)炎效果等生理調(diào)節(jié)方面有重要作用。

β-甘露糖苷酶作為一種工具酶，它還可以使腐爛植物材料糖化來用作家禽飼料添加劑。另有研究報(bào)道，β-甘露糖苷酶在生物燃料和生物塑料工業(yè)發(fā)揮重要作用。目前國際上報(bào)道的β-甘露糖苷酶主要是來源于一些真菌（如黑曲霉）以及一些常溫、中溫細(xì)菌，而來源于極耐熱細(xì)菌及古菌的β-甘露糖苷酶鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種極耐熱甘露糖苷酶基因，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述極耐熱甘露糖苷酶基因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種極耐熱甘露糖苷酶基因的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種極耐熱甘露糖苷酶基因，其DNA序列如SEQ?NO：1所示。

上述的極耐熱甘露糖苷酶基因表達(dá)的極耐熱甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ?NO：2所示。

一種極耐熱甘露糖苷酶，氨基酸序列為權(quán)利要求2所述的SEQ?NO：2序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白質(zhì)。

一種重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ?NO：1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。

一種用于擴(kuò)增極耐熱甘露糖苷酶基因的引物，所使用的引物對為：

man1：5’-GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’?；

man2：5’-CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’?。

上述的極耐熱甘露糖苷酶在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為70-95℃，pH5.0-7.5。所述的甘露聚糖來源于天然植物的甘露聚糖。

上述的重組體系在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的應(yīng)用。

上述的極耐熱甘露糖苷酶在酶解角豆樹甘露聚糖中的應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的甘露糖苷酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和中性pH條件下高活性的特性，在85℃、pH5.5的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到144.6U/mg；該蛋白酶在溫度為70℃-95℃、pH為5.0-7.5的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該甘露糖苷酶的耐熱性能極高，在75℃的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的甘露糖苷酶比現(xiàn)有甘露糖苷酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80℃以上高溫、偏酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。該甘露糖苷酶因其具有高效的酶解能力及較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因此可作為一種高效的工業(yè)酶制劑用于甘露糖的生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是甘露糖苷酶Tth?manB的SDS-PAGE蛋白電泳圖；

圖2是Tth?manB的最適溫度結(jié)果圖；

圖3是Tth?manB的最適pH結(jié)果圖；

圖4是Tth?manB的熱穩(wěn)定性結(jié)果圖；

圖5是Tth?manB降解角豆樹甘露聚糖的TLC圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

以下實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1?甘露糖苷酶基因Tth?manB的制備

可采用如下人工合成的方式制備Tth?manB基因，也可以以Thermotoga?thermarum?DSM5069?(DSMz，German)?的總DNA為模板通過常規(guī)PCR方法得到（引物采用實(shí)施例2的引物man1、2）。

本實(shí)施例的甘露糖苷酶基因Tth?manB通過上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ?NO：1所示。

實(shí)施例2?甘露糖苷酶基因Tth?manB的亞克隆

用下述引物對PCR擴(kuò)增實(shí)施例1中的甘露糖苷酶基因：