[發(fā)明專利]豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測ELISA試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210553103.1
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103033614A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董建輝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司;湖南農(nóng)大動物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測ELISA試劑盒，其特征在于以GenBank中PCV2-TJ毒株基因序列為模板表達(dá)PCV2型核衣殼Cap蛋白，并通過如下步驟完成豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測ELISA試劑盒的制備，具體步驟如下：

1)抗體檢測板包被抗原的制備：以GenBank中PCV2-TJ(序號AY181946)毒株基因序列為模板，用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)一對特異性引物，上游引物：5’-GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC-3’；下游引物：5’-GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT-3’，在兩條引物的5’端分別加入FokI和SalI酶切位點(diǎn)，以PCV-2感染的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的DNA產(chǎn)物為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了實(shí)驗(yàn)室分離毒株P(guān)CV-2的Cap蛋白全基因，通過設(shè)計(jì)的FokI/SalI雙酶切位點(diǎn)，將目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表達(dá)載體pP-secSUMO3中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，用PCR和雙酶切方法鑒定得到重組菌株pP-secSUMO3-Cap，其中的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)純化、線性化處理后用BioRad公司電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，Zeocin濃度梯度篩選高拷貝菌株，挑取單克隆菌培養(yǎng)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選陽性表達(dá)菌，最后將重組陽性表達(dá)酵母菌上清經(jīng)鎳柱純化分離后，加入SUMO蛋白酶同步進(jìn)行透析和標(biāo)簽切除，再次過鎳柱純化后制得制得PCV2型核衣殼Cap蛋白。

2)抗體檢測板的制備：將制備的包被抗原Cap蛋白加入到0.05mol/L?pH9.6的碳酸鹽緩沖液中進(jìn)行稀釋，以每孔包被濃度為1ug/ml的量分別加入96孔抗體檢測板中，4℃包被過夜，用含體積濃度0.05％吐溫-20的pH7.4的1mol/L?PBS溶液洗滌三次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂奶粉在37℃下封閉2小時(shí)，用以上PBS溶液洗滌三次，在室溫下風(fēng)干，包裝。

3)酶標(biāo)抗原的制備：在5mg/ml的辣根過氧化物(HRP)溶液中，加入0.2ml的0.1mol/L的NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，加入20μl?0.2mol/L?pH9.5的碳酸鹽緩沖液，使pH升高到9.0，然后立即加入2mlCap蛋白至1ml?0.01mol/L碳酸鹽緩沖液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，回放0.1ml的4mg/ml?NaBH₄溶液，在攪拌下加入等體積的硫酸銨，放置1小時(shí)后3000rpm離心30分鐘，棄上清，將沉淀溶于pH7.4的0.15mol/L?PBS中，將PBS進(jìn)行透析，12000rpm離心離30分鐘，去除沉淀，上清即為所需的酶標(biāo)抗原。

4)底物顯色液的制備：將0.2g四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶解在100ml二甲基亞砜(DMSO)溶液中，定容至1L，即為底物顯色A液；將9.33g檸檬酸和14.6g磷酸氫二鈉加入到質(zhì)量體積比為0.75％的過氧化氫尿素6.4ml中，調(diào)pH值到5.0，定容至1L，即為底物顯色B液。將底物顯色A液與B液等體積混合，量取111.2ml的18mol/L濃硫酸，用混合顯色液將其稀釋定容至1000ml。

5)樣品稀釋液的制備：配制pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。

6)洗滌液的制備：配制含體積濃度0.5％吐溫-20的pH7.4的1mol/L?PBS溶液做為10倍濃縮的洗滌液。

7)終止液的制備：配制2mol/L硫酸溶液。

8)陽性血清和陰性血清的制備：標(biāo)準(zhǔn)的PCV2型抗體陽性和陰性血清。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測ELISA試劑盒，其特征在于所述抗體檢測試劑盒內(nèi)包含有抗體檢測板、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗原、洗滌液、底物顯色液、終止液、陽性血清和陰性血清。