[發(fā)明專利]一種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210546754.8
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN103026966A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金鳳媚;薛琳;薛俊;楊迎霞;吉立柱;郝志愚
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速、簡捷、高效的番茄黃化曲葉病毒抗性鑒定方法。

背景技術(shù)

目前鑒定番茄黃化曲葉病抗性的方法有煙粉虱傳毒、嫁接接種和機(jī)械傳毒等。嫁接法以嫩病葉做接穗，采用腹接法接種到健康番茄上，其優(yōu)點是能夠為待鑒定植株提供高含量的TYLCV病毒，但該方法耗時耗力，只適于少量鑒定。機(jī)械傳播是在人工環(huán)境下把感染TYLCV的曼陀羅、心葉煙或潘那利番茄作為毒源，通過機(jī)械傳播侵染健康番茄植株，成功率較低，且病毒從番茄傳到番茄上成功的例子只有很少的報道，因此在接種中一般不用該方TYLCV病毒。在育種進(jìn)程中最常用的接種方法是煙粉虱接種鑒定法，包括溫室中煙粉虱接種、回型籠中煙粉虱接種、露地?zé)煼凼臃N3種類型，但這個方法也有一些缺點：1.?蟲口密度不均一對抗性鑒定的影響。若蟲口密度過大，一些抗病品種也會表現(xiàn)出感病來；若蟲口密度太小，又區(qū)分不出抗感品種，目前對蟲口密度的要求還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)。2.蟲子逃逸引起病害的大面積發(fā)生。煙粉虱的體長一般為1-2mm，它可隨著調(diào)查人員的進(jìn)出而逃逸出來，從而給周圍番茄產(chǎn)區(qū)帶來災(zāi)害。3.受季節(jié)限制。煙粉虱的最佳活動溫度是26-28℃，低于15℃蟲子基本不活動，也就不能傳毒，這就會延緩接種鑒定的進(jìn)程。

農(nóng)桿菌接種法是近年來發(fā)展起來的一種病毒抗性鑒定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通過根癌農(nóng)桿菌侵染待鑒定植株，病毒DNA可在植物體內(nèi)形成、復(fù)制、運(yùn)輸并誘發(fā)癥狀。侵染性克隆技術(shù)首先在噬菌體病毒Qβ、脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）中獲得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist?等（1984）在雀麥花葉病毒（Brome?mosaic?virus，BMV）首次報道，至今國內(nèi)外已有大量的植物病毒被成功地構(gòu)建出全長cDNA?侵染性克隆，并證明通過農(nóng)桿菌注射能誘導(dǎo)出病毒侵染癥狀（Zhang?et?al.,2010,2009；Jin?et?al.，2011）。但該方法在注射接種后需放置在有防蟲設(shè)施的防蟲網(wǎng)內(nèi)，且發(fā)病周期較長要一個月左右才能表現(xiàn)出癥狀。

因此，鑒于以上TYLCV接種方法的不足之處，在番茄抗病育種的生產(chǎn)上迫切需要一種快速方便的抗性鑒定方法，本研究利用離體葉片通過農(nóng)桿菌侵染即可鑒定出番茄對TYLCV的抗性，本方法從而加快抗病育種進(jìn)程，對推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對傳統(tǒng)技術(shù)不能準(zhǔn)確地對TYLCV抗性進(jìn)行鑒定的問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，利用天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆，通過離體葉片接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對該病毒的抗性。此方法無需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡便有效的接種鑒定方法。本發(fā)明旨在提供一種簡便的接種鑒定方法，通過該方法能科學(xué)高效準(zhǔn)確地鑒定出番茄對TYLCV的抗性。

為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，按如下的步驟進(jìn)行：

（1）侵染性克隆菌液的培養(yǎng)：將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404接種在含50?ug/mL?Kan和50?ug/mL?Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200?rpm振蕩培養(yǎng)48?h；

（2）菌液的收集：用5000rpm離心機(jī)離心收集菌體，用液體MS培養(yǎng)基重新懸浮菌體，調(diào)OD600值為0.5；其中MS培養(yǎng)基配方如下：

含100uM乙酰丁香酮；

（3）葉片處理：取5-6片苗齡的番茄葉片，在無菌操作臺上用75%（V/V）的酒精表面消毒30?s，再用0.1%升汞（升汞即氯化汞）消毒3.5?min，無菌水沖洗5~6次，將葉片剪成1cm×2?cm大小的葉片塊；

（4）離體葉片接種：將剪好的長方形葉片塊置于含有侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404中浸泡20min后，接種到MS培養(yǎng)基含（100uM乙酰丁香酮）上，25℃共培養(yǎng)2?-3天，然后將葉片用滅菌水清洗3遍，再轉(zhuǎn)移到含有濃度為500mg/l頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基上，7天后進(jìn)行觀察和測量；所述的用滅菌水為內(nèi)含有500mg/l頭孢霉素的水。在MS培養(yǎng)基上根據(jù)需要還可以添加不同濃度的GA3（赤霉素）。