[發(fā)明專利]豬Xist基因序列、豬anti-Xist siRNA序列及通過抑制豬Xist基因表達來提高豬克隆效率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210543946.3
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103173456A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃志華;劉德武;李紫聰;袁玉娟;吳珍芳
• 申請（專利權(quán)）人: 吳珍芳;李紫聰
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/113;C12N15/89;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 廣州天河恒華智信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44299
• 代理人: 區(qū)長釗

1.一種豬Xist基因序列，其特征在于，所述序列為如序列表SEQID?NO：1所述。

2.一種豬anti-Xist?siRNA序列，其特征在于，所述序列為如序列表SEQ?ID?NO：2和3所述。

3.一種豬anti-Xist?siRNA序列，其特征在于，所述序列為如序列表SEQ?ID?NO：4和5所述。

4.一種豬anti-Xist?siRNA序列，其特征在于，所述序列為如序列表SEQ?ID?NO：6和7所述。

5.一種豬anti-Xist?siRNA序列，其特征在于，所述序列為如序列表SEQ?ID?NO：8和9所述。

6.一種通過抑制如權(quán)利要求1所述基因表達來提高豬克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通過以下步驟實現(xiàn)：

1）豬Xist基因的電子克?。簩ε！⑿∈蟆⑷说牡腦ist的核苷酸序列進行同源性分析，獲得相似性90%以上的表達序列標簽；對匹配分數(shù)高的EST序列進行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist?RNA序列；

2）有效anti-Xist?siRNA序列的篩選：以母豬cDNA為模版，設(shè)計引物，進行定量PCR反應(yīng)，篩選有效的anti-Xist?siRNA序列；

3）anti-Xist?siRNA1顯微注射豬早期核移植胚胎；

4）anti-Xist-siRNA1轉(zhuǎn)染核移植的供核細胞，用anti-Xist?siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表達，提高體外培養(yǎng)豬克隆胚胎的囊胚內(nèi)細胞數(shù)。

7.一種通過抑制如權(quán)利要求1所述基因表達來提高豬克隆效率的方法，其特征在于，所述方法為用anti-Xist?siRNA顯微注射激活后豬的核移植重構(gòu)胚，具體步驟如下：

1）豬Xist基因的電子克?。簩ε！⑿∈?、人的的Xist的核苷酸序列進行同源性分析，獲得相似性90%以上的表達序列標簽；對匹配分數(shù)高的EST序列進行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist?RNA序列；

2）設(shè)計合成anti-Xist?siRNA序列；

3）篩選出有效的anti-Xist?siRNA；

4）制備豬的核移植重構(gòu)胚，將有效的anti-Xist?siRNA序列顯微注射到激活后的核移植重構(gòu)胚中；

5）將處理后的重構(gòu)胚移植到代孕母豬體內(nèi)，提高克隆效率。

8.一種通過抑制如權(quán)利要求1所述基因表達來提高豬克隆效率的方法，其特征在于，所述方法為用anti-Xist?siRNA直接轉(zhuǎn)染核移植的供體細胞，具體步驟為：

1）豬Xist基因的電子克?。簩ε?、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列進行同源性分析，獲得相似性90%以上的表達序列標簽；對匹配分數(shù)高的EST序列進行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist?RNA序列；

2）設(shè)計合成anti-Xist?siRNA序列；

3）篩選出有效的anti-Xist?siRNA；

4）用有效的siRNA轉(zhuǎn)染核移植的供核細胞；

5）用處理后的供核細胞制備克隆胚胎以期提高克隆效率。

9.一種通過抑制如權(quán)利要求1所述基因表達來提高豬克隆效率的方法，其特征在于，所述方法為直接敲除核移植的供體細胞中Xist基因，具體步驟為：

1）豬Xist基因的電子克?。簩ε！⑿∈?、人的的Xist的核苷酸序列進行同源性分析，獲得相似性90%以上的表達序列標簽；對匹配分數(shù)高的EST序列進行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist?RNA序列；

2）設(shè)計同源重組打靶質(zhì)粒制備敲除Xist序列的細胞系；

3）用第2）步驟的細胞系作為核移植的供核細胞制備克隆豬，以提高克隆效率。

10.一種通過抑制如權(quán)利要求1所述基因表達來提高豬克隆效率的方法，其特征在于，所述方法為制備抗Xist基因的轉(zhuǎn)基因豬，具體步驟為：

1）豬Xist基因的電子克?。簩ε?、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列進行同源性分析，獲得相似性90%以上的表達序列標簽；對匹配分數(shù)高的EST序列進行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist?RNA序列；

2）設(shè)計合成anti-Xist?siRNA序列；

3）篩選出有效的anti-Xist?siRNA；

4）用有效的anti-Xist?siRNA構(gòu)建anti-Xist?shRNA質(zhì)粒；

5）用anti-Xist?shRNA質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)基因細胞系；

6）用第5）步驟的細胞系作為核移植的供核細胞制備克隆豬，以提高克隆效率。