[發明專利]一個水稻組成型啟動子功能區域的鑒定及應用

有效

• 申請號: 201210543608.X
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103421783A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 何予卿;彭波
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域。具體涉及一個水稻組成型啟動子鑒定及應用。?

背景技術

高等生物的生長發育是不同基因在不同的時間和空間上有序表達和協同作用的過程，在此過程中基因的表達情況(開啟、關閉、表達部位、表達時間、表達量的高低)都是受到驚喜的調控的。基因表達的調控可以分轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平四個層面上的調控方式，其中轉錄水平的調控最經濟、靈活，又是最為重要和復雜的調控。因此與轉錄水平相關的順式因子稱為啟動子(指RNA聚合酶特異性識別并與之結合從而起始轉錄下游基因的一段DNA序列)，它控制了基因表達的時間、組織及表達量的高低。而啟動子是在轉錄水平上調控基因表達最重要的順式元件之一，它與RNA聚合酶以及其他作為反式元件的蛋白輔助因子之間的相互作用是啟動子調控模式的實質。植物啟動子，根據其驅動的基因的表達情況的不同可以分為組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子。另外還有雙向啟動子和可變啟動子這兩類較特殊的啟動子。但這種分類只是相對的，在特定的情況下，有些啟動子往往也兼備其它類型啟動子的特性。啟動子作為在轉錄水平上調控基因表達重要的調控元件，是許多轉錄因子和RNA聚合酶作用的靶標，因此深入研究啟動子的結構、功能區域、作用模式及其功能等對于回答生物學中一些基本理論問題具有重大意義。?

在植物基因工程中，根據外源基因表達的需要，如果需要外源基因在植物中能夠持久、穩定、高效地表達，使外源基因表達的產物充分發揮其功能或研究基因的功能時，一般都使用組成型啟動子。組成型啟動子驅動外源基因在植物各個組織均表達，但是在具體的應用中逐漸暴露出一些問題，如外源基因的表達具有持續恒定表達的特性，會過度消耗植物體內的營養物質和能量，從而對植物的營養物質的吸收帶來巨大壓力，同時也會產生許多異源蛋白和代謝物質，但是這些產物對受體植物可能是不需要的，有的可能是有毒的，進而會影響到植物的正常生長發育，嚴重時將導致死亡(Ehsani?et?al.，2003；Miyao?and?Fukayama，2003；。而同時使用同一個啟動子驅動多個外源基因可能就會引起基因沉默或者共抑制等現象(Kumpatla?et?al.，1998)。目前在植物基因工程中廣泛應用的組成型啟動子主要來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子、根癌農桿菌Ti質粒的胭脂堿合成酶基因NOS啟動子、水稻Actl啟動子和玉米泛素蛋白Ubiquitin啟動子。植物基因工程中應用最為廣泛的組成型啟動子為完整的35S啟動子，它在轉基因水稻、擬南芥、馬鈴薯、小麥等高等植物研究中都有廣泛的應用。在植物基因工程中應用從病毒中克隆出來的啟動子序列，可能存在潛在的生物不安全性，因此，從植物克隆活性強的內源型組成型啟動子非常重要。?

真核生物RNA聚合酶有三種，因此與之對應的啟動子有三類，I型啟動子主要用來轉錄5srDNA，需要通過通用轉錄因子(TFIIA，TFIIB和TFIIC)的結合來定位RNA聚合酶。II型啟動子主要用于tRNA基因的轉錄，但是需要通過TFIIB和TFIIC的結合來定?位RNA聚合酶。III型啟動子主要用于scRNA基因的轉錄，則需要TFIIB和其他的輔助因子的參與(魏晶，2011)。其中II型啟動子為最主要的啟動子，其基本結構如圖1所示。?

基本啟動子是RNA聚合酶結合的位點，因此它決定基因轉錄的起始(Juven-Gershon?et?al.，2006)。基本啟動子包括兩個保守的結構，一是轉錄的起始位點(initiator.簡寫為Inr)，即為前體mRNA帽子位點。轉錄的起始位點兩側的序列相對比較保守，通常表示為PyPyANPuPy，其中Py代表嘧啶，Pu代表嘌呤，N代表任意堿基，A為起始位點(+1)(Juven-Gershon?et?al.，2008)。另一個共同的保守結構是位于轉錄起始位點上游-25～-30為中心的7bp左右的共同序列為TATAAAA(非模板鏈的序列)的保守區域(TATAbox)，該保守區域的第5、7位的A常常被T取代，因此保守序列的堿基頻率是T95A87T93A85A63A83A50(楊歧生等，2003)。而TATA?box和Inr之間的核苷酸序列對轉錄的速率有重要的影響，雖然它不會改變轉錄的起始位點，但是這兩個保守序列之間的距離對精確的轉錄起始非常重要，如果延長或者縮短兩元件間的距離則可能導致轉錄活性的喪失(Zhu?et?al.，1995)。?