[發明專利]人工創制榨菜細胞質雄性不育系的方法

無效

• 申請號: 201210541385.3
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103014020A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 楊景華;張明方
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于種質資源創新領域，具體涉及一種人工創制榨菜細胞質雄性不育系的方法。

背景技術

細胞質雄性不育在作物雜種優勢利用中有著重要的應用價值。由于細胞質雄性不育不能產生正常的功能花粉，因此，利用雄性不育既可以省去人工去雄的手續，又可以保證雜交一代種子的純度，同時它又是研究花粉發育、細胞質遺傳和核質互作的良好的實驗系統。十字花科作物存在著明顯的雜種優勢，目前雜種一代的生產主要是利用自交不親和性和雄性不育性兩種途徑，細胞質雄性不育由于其理論上可以獲得100%不育度和不育率的材料，因此，在十字花科作物優勢育種利用中有著更廣闊的前景，十字花科中許多重要的經濟作物，如白菜、甘藍、甘藍型油菜等都選育出了綜合性狀良好的細胞質雄性不育系。

榨菜，統稱榨菜，是中國的特產蔬菜，屬于十字花科植物，在浙江和四川等地有著廣泛的栽培，經濟價值大，是重要的加工蔬菜，生產上存在品質下降和病毒病嚴重等問題，而雜種優勢的利用可以改良現有榨菜品種的品質及提高抗性。由于榨菜類作物自交親和指數非常高，目前沒有發現優良自交不親和系，生產上很難利用自交不親和系進行雜種優勢的利用。迄今為止，在十字花科作物中，在生產上已經應用的細胞質雄性不育系主要有?Ougra型的蘿卜細胞質雄性不育系、Brassica?nap型甘藍型油菜細胞質雄性不育系以及Brassica?pol型甘藍型油菜細胞質雄性不育系，這些類型的細胞質雄性不育系已經在生產中廣泛應用。榨菜類作物細胞質雄性不育創制研究對于榨菜雜種優勢的利用具有重要意義，同時對于其他十字花科作物細胞質雄性不育系的人工創制及雜種優勢的利用具有借鑒意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種人工創制榨菜細胞質雄性不育系的方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種榨菜細胞質雄性不育基因orf220，該基因具有SEQ?ID?NO：3所述的核苷酸序列。

備注說明：SEQ?ID?NO：3中的tga(661-663)為終止密碼子，不編碼氨基酸。

本發明還同時提供了上述榨菜細胞質雄性不育基因orf220編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ?ID?NO：1?所示的氨基酸序列。

本發明還同時提供了上述榨菜細胞質雄性不育基因orf220在線粒體中定位表達的線粒體定位肽，該線粒體定位肽具有SEQ?ID?NO：2?所示的氨基酸序列。

本發明還同時提供了上述榨菜細胞質雄性不育基因orf220的用途：用于創制榨菜細胞質雄性不育系。

本發明還同時提供了一種榨菜細胞質雄性不育系的創制方法：構建orf220基因線粒體定位表達載體，農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化至正常可育榨菜中，獲得榨菜細胞質雄性不育系，人工創制的榨菜細胞質雄性不育系特征為：

（1）?orf220基因在線粒體中定位表達；

（2）?所獲得的人工材料表型為雄性不育，雌性可育。

作為本發明的榨菜細胞質雄性不育系的創制方法的改進，將PBI121-atpβ-orf220的線粒體定位表達載體轉入LBA4404農桿菌；通過農桿菌介導轉化至正常可育榨菜，獲得轉基因植株。

本發明還同時提供了PBI121-atpβ-orf220的線粒體定位表達載體的構建方法，包括以下步驟：

①、將含有orf220基因的pUCM-T載體用BamHⅠ和SacⅠ酶切，回收基因片段，然后連入PBI121表達載體，構建PBI121-orf220載體；

②、將含有atpβ基因線粒體定位肽的pUCM-T載體用XbaⅠ和BamHⅠ酶切，回收基因片段，然后連入PBI121-orf220載體中，酶切鑒定，構建為PBI121-atpβ-orf220的線粒體定位表達載體。

SEQ?ID?NO：1

MPQLDKFTYFSQFFWLCLFFFTFYIFICNDGDGVLGISRILKLRNQLLSHRGKTIQSKVRKNRSSDSSRLEVLAFAINYFLFFVIPRLWPYIYIGYGLKFLLGLKYGIFQNEILTLGVGPDGVAPPDINERAPLHLLYADVESSDSQQARNNAMLAHLNRIEYITHDLEGERDIVRRQALIDIMKWEIRSLQQHFRVFRHLDRVRDAQRARMNEILDLFR

SEQ?ID?NO：2

MASRRLLASLLRQSAQRGGPISRSLGNSIPKSVSRASSRASPKGFLLNRAVQYATSA

具體而言，本發明的技術方案如下：

基因克隆：