[發明專利]一種體外誘導擴增NKT細胞的方法

無效

• 申請號: 201210541319.6
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN102978160A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 唐田娟;蘇國新;葉永清
• 申請（專利權）人: 上海柯萊遜生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權;錢品興

[技術領域]

本發明涉及NKT細胞的誘導擴增方法，具體涉及一種體外誘導擴增NKT細胞的方法。

[背景技術]

自然殺傷T細胞（NKT細胞）是繼T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）之后又一類新型的T淋巴細胞，屬于第4類免疫細胞。作為一種新型的免疫調節細胞，NKT細胞既表達T細胞的表面標志，又表達NK細胞的表面標志，NKT細胞具有細胞毒性和免疫調節作用。近幾年在其表型特征、分布及發育、免疫學效應及與疾病關系、腫瘤治療等方面的研究有了很大進展。

NKT?細胞最顯著的特征是其表達的TCR和NK細胞的激活受體，NKT細胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在外臍血中也有NKT細胞。?NKT細胞最佳刺激效應物是α半乳糖神經酰胺（glycolipid?α-galactosylceramide，α-GalCer），是一類來源于海綿體或者共生微生物的的提取物。最近，許多內源性的哺乳動物自身的脂質體也是CD1d的配體，能被NKT識別。

在細胞毒方面，NKT細胞在自身配體及合成配體的刺激下，其表面的IL-12受體活化，刺激DC細胞分泌大量的IL-12，并促使未成熟DC細胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌IFN-γ，同時IFN-γ作用于NK細胞促使NK細胞亦分泌大量的穿孔素?，DC細胞分泌的IL-12作用于初始CD4T細胞，使其向Thl極化，上述因素共同作用而介導某些病毒感染、胞內寄生菌感染的靶細胞和腫瘤靶細胞發生溶解破壞；也可通過表達?FasL,?經?Fas/FasL途徑使上述靶細胞發生凋亡。在免疫調節作用：活化NKT細胞可分泌IL-4和IFN-γ等細胞因子。IL-4可誘導CD4+Th0細胞向CD4+Th2?細胞分化，參與體液免疫應答或超敏反應；?IFN-γ與IL-12協同作用,?可使?CD4+Th0細胞向CD4+Thl?細胞分化，增強細胞免疫應答。此外?NKT?細胞還可分泌多種趨化性細胞因子等參與炎癥反應。

總之，NKT細胞作為一類新型的免疫調節細胞，在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中具有遠大的應用前景。

[發明內容]

為了解決現有技術中的不足，本發明提供一種體外誘導擴增NKT細胞的方法，該方法誘導擴增出的NKT細胞分泌細胞因子水平高，殺瘤活性高。

為實現上述目的，設計一種體外誘導擴增NKT細胞的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成：

a.IL-2和GM-CSF共培養DC細胞，

b.α-GalCer對DC細胞的負載，

c.用α-GalCer負載的DC細胞培養NKT細胞。

所述的IL-2和GM-CSF共培養DC細胞由以下步驟組成：用淋巴細胞分離液分離初外周血單個核細胞，用1640培養液調整PBMC濃度為2~4×10⁶/ml，置于37℃、5%的CO₂培養箱，用1640培養液洗板2次，加入含有IL-2，GM-CSF的培養液，置于37℃、5%的CO₂培養箱2小時。

所述的α-GalCer對DC細胞的負載由以下步驟組成：保存5天后，在培養的DC細胞中加入α-GalCer，24小時后收集細胞。

α-GalCer負載的DC細胞培養NKT細胞由以下步驟組成：用含有IL-2、IL-15和α-GalCer的培養液調整洗板后的懸浮淋巴細胞濃度至1~2×10⁶?/ml，在37℃、5%的CO₂培養箱中培養5天；在第3~4天進行補液及傳代；其中第0天、7天、14天加入DC細胞共培養，第21天收獲細胞。

所述的IL-2的濃度為100U/ml。

所述的GM-CSF濃度為50ng/ml。

所述的α-Galcer濃度為100ng/ml。

步驟（c）中，IL-2的濃度為50U/ml。

步驟（c）中，IL-15的濃度為50ng/ml。

步驟（c）中，α-Galcer的濃度為50ng/ml-500ng/ml。

與常規方法比較僅使用NKT培養液培養的NKT細胞相比，本發明的方法有以下優點：用α-GalCer激活的DC細胞可促進NKT細胞擴增，其效果明顯優于單獨用α-GalCer。

與常規僅使用α-GalCer培養NKT細胞的培養方法相比，本發明的方法具有以下優點：

1.α-GalCer作為一種糖脂類抗原，用其負載的DC細胞能夠充分刺激NKT細胞增殖。