[發明專利]快速準確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法

無效

• 申請號: 201210535646.0
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103865983A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 仇雪梅;于旭蓉;常亞青;王秀利;徐進
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學;仇雪梅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種牡蠣的鑒別方法，尤其是一種操作簡單、成本低的快速準確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法。

背景技術

牡蠣其肉質鮮美、營養豐富，是世界上產量最大的經濟貝類，在我國也已被廣泛地推廣養殖。雖然我國沿海自然分布的牡蠣有20多種，但只有太平洋牡蠣、近江牡蠣等是主要的養殖品種。在對牡蠣的基礎研究、資源開發和保護利用中，都需要先對牡蠣進行準確分類，繼而才能對此種牡蠣的形態、表型、軟體重、顏色、殼長、殼高、殼寬、營養成分及繁殖能力等進行研究。近年來，盡管國內專家對牡蠣系統分類進行了大量的研究報道，但由于牡蠣基因組學的研究不發達，使得大部分學者認為牡蠣軟體部的結構差異小，可提供的基因分類證據較少。因此，目前對于牡蠣只能通過經典分類學進行分類，即比較牡蠣的表型形態、比較解剖、生活習性等進行分類，存在著分類不準確的問題，尤其是難以將太平洋牡蠣及近江牡蠣進行區分。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的技術問題，提供一種操作簡單、成本低的快速準確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法。

本發明的技術解決方案是：一種快速鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法，其特征在于按如下步驟進行：

a.??提取牡蠣樣本基因；

b.???對牡蠣樣本基因進行PCR擴增，得到目的片段的PCR產物；

上游引物CaM?F：5'-?ATGGCCGATCAACTCACAG-?3'

下游引物CaM?R：5'-?GCCTTGAGTGGAAGTCGAT-?3'

c．對已得到的PCR產物進行Bln?Ⅰ單酶切，并對酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；

d.?根據擴增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被Bln?Ⅰ單酶切的基因片斷是近江牡蠣。

所述a步驟是用酚-仿抽提法從牡蠣閉殼肌中提取牡蠣的全基因組DNA，并將DNA樣品溶于去離子滅菌水，濃度在100ng/ml。

本發明可以在對近江牡蠣和太平洋牡蠣進行區分時，將兩種牡蠣的基因提取出來，通過PCR擴增得到兩種牡蠣CaM基因890bp目的片段，再通過檢測兩種牡蠣CaM基因890bp目的片段的Bln?Ⅰ酶切產物大小，以區分二種牡蠣，具有操作簡單、成本低廉、快速、準確等優點，可以為經濟牡蠣遺傳種質鑒定、系統進化分析、選育和雜交育種工作提供依據。

附圖說明

圖1是本發明實施例二種牡蠣基因組DNA?1.0%瓊脂糖電泳圖譜。

圖2是本發明實施例二種牡蠣CaM基因目的片段PCR擴增圖。

圖3是本發明實施例二種牡蠣CaM基因目的片段BlnⅠ單酶切瓊脂糖圖。

圖4是本發明實施例二種牡蠣群體BlnⅠ單酶切瓊脂糖鑒定圖。

具體實施方式

a．選取兩種牡蠣（太平洋牡蠣養殖群體購自天津水產養殖場，近江牡蠣樣本購自海南水產養殖場），取每個牡蠣的閉殼肌于EP管中，加入濃度為70%的乙醇，﹣20℃保存備用；參照薩姆布魯克等經典酚-仿抽提法從冷凍保存的牡蠣閉殼肌中提取牡蠣的全基因組DNA，并將DNA樣品溶于去離子滅菌水，濃度在100ng/ml，-20℃凍存備用；

b．設計適用于二種牡蠣CaM基因目的片段擴增引物序列，對a步驟所得樣本基因進行PCR擴增，得到目的片段的PCR產物；

上游引物CaM?F：5'??ATGGCCGATCAACTCACAG???3'

下游引物CaM?R：5'??GCCTTGAGTGGAAGTCGAT??3'

c．對已得到的PCR產物進行Bln?Ⅰ單酶切，并對酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；

d.?根據擴增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被Bln?Ⅰ單酶切的基因片斷是近江牡蠣。

二種牡蠣基因組DNA?1.0%瓊脂糖電泳圖譜如圖1所示：圖中M：?DL2000?marker；1：太平洋牡蠣DNA；2：近江牡蠣DNA。

二種牡蠣CaM基因目的片段PCR擴增瓊脂糖電泳圖如圖2所示：圖中M：Marker，DL2000；1：太平洋牡蠣：2：近江牡蠣。

二種牡蠣CaM基因目的片段BlnⅠ單酶切瓊脂糖電泳圖如圖3所示：圖中M：Marker，DL2000；1:近江牡蠣BlnⅠ酶切片段890bp；2：太平洋牡蠣BlnⅠ酶切片段663bp和227bp。