[發明專利]一種利用卡那霉素快速篩選菊花轉基因植株的方法

有效

• 申請號: 201210534830.3
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103004585A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 陳發棣;劉鵬;蔣甲福;陳素梅;李佩玲;管志勇;房偉民
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H1/04
• 分類號: A01H1/04;A01H4/00;C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種利用卡那霉素快速篩選菊花轉基因植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）確定菊花葉盤不定芽分化Kan篩選濃度、菊花莖段生根Kan篩選濃度以及Kan溶液浸泡篩選濃度和觀察時間：

菊花葉盤不定芽分化Kan篩選濃度的確定：將非轉基因菊花葉盤接種到含有不同濃度的Kan的再生培養基上，找到一個剛好能100%抑制菊花葉盤不定芽分化的Kan臨界濃度，即為菊花葉盤不定芽分化Kan篩選濃度；

菊花莖段生根Kan篩選濃度的確定：將非轉基因菊花帶頂芽莖段接種到含有不同濃度的Kan的生根培養基上，找到一個剛好能100%抑制菊花莖段生根的Kan臨界濃度，即為菊花莖段生根Kan篩選濃度；

Kan溶液浸泡篩選濃度和觀察時間的確定：取長勢一致的非轉基因菊花的第三片全展葉，洗凈后置于盛有少量不同濃度Kan溶液的培養皿中，加入溶液量以剛好浸沒葉片為準，根據葉片受害情況確定Kan篩選濃度和觀察時間；

（2）采用步驟（1）所確定的菊花葉盤不定芽分化Kan篩選濃度、菊花莖段生根Kan篩選濃度對菊花轉化植株進行分化再生階段和生根階段的篩選得到生根株系；然后再采用步驟（1）確定的Kan溶液浸泡篩選濃度和觀察時間將所述的生根株系經Kan溶液浸泡篩選后得到轉基因菊花Kan抗性株系；

（3）轉基因菊花的PCR驗證：根據轉基因載體中的35S啟動子序列設計引物對步驟（2）篩選的轉基因菊花Kan抗性株系進行PCR?擴增，驗證載體片段是否插入菊花基因組。

2.根據權利要求1所述的利用卡那霉素篩選菊花轉基因植株的方法，其特征在于步驟（1）中所述的再生培養基為：MS培養基?+?6-BA?1.0?mg·L^-1?+?NAA?0.5?mg·L^-1，所述的生根培養基為：1/2?MS培養基，即MS培養基中的大量元素減半，其他成分不變。

3.根據權利要求1所述的利用卡那霉素篩選菊花轉基因植株的方法，其特征在于步驟（1）中所述確定Kan溶液浸泡篩選濃度和觀察時間的方法為根據菊花葉片的受害程度，把菊花葉片對Kan處理后的最終反應程度劃分為4個等級：Ⅰ級：葉色正常，受害病斑未出現；Ⅱ級：葉色輕微變黃，受害病斑占葉面積0～5%；Ⅲ級：葉色變黃，受害明顯，與正常葉片差異明顯，受害病斑占葉面積5%～10%；Ⅳ級：葉片失綠，褐色病斑大面積出現，受害病斑占葉面積10%以上；菊花葉片剛好出現明顯受害癥狀即Ⅲ級反應的處理濃度為臨界篩選濃度，葉片受害級數基本不變的處理時間為觀察時間。

4.根據權利要求1所述的利用卡那霉素篩選菊花轉基因植株的方法，其特征在于步驟（3）中所述根據轉基因載體中的35S啟動子序列設計引物的序列為：

35S-F：5’-?AGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGG-3’；

35S-R：5’-?TTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAG-3’。