[發明專利]磷光二氧化硅納米顆粒標記的免疫層析方法及其檢測試紙

有效

• 申請號: 201210532068.5
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN103353523A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 張改平;宋春美;職愛民;楊繼飛;趙東;胡驍飛
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域：本發明涉及一種免疫層析檢測方法，特別是一種以磷光二氧化硅納米顆粒為標記物的快速免疫層析檢測方法及其檢測試紙條。所說的磷光二氧化硅納米顆粒是經高溫煅燒后的二氧化硅納米顆粒。?

二、技術背景：

?免疫分析標記技術是指以抗原杭體間的特異性反應為基礎，標記以各種標記物(定量信號)來對某種物質進行定性或定量檢測的研究。標記免疫分析一般是將酶、熒光素、放射性核素等標記物對抗休或抗原進行標記，這種標記物既保持了抗體或抗原的活性，也不影響標記物的活性，當它與相應抗體或抗原反應后，可以直接測定復合物中的標記物，從而直接對目標物質進行定量分析。通過標記物的信號放大作用，可以提高免疫分析技術的敏感性。隨著全世界對食品安全、人類健康等重大問題的關注程度越來越高，我們需要快速、準確、靈敏、能進行多組分分析的檢測技術來解決威脅人類健康的種種問題。免疫學檢測技術以其特異性強、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、檢測成本低、安全可靠等優點，已成為21世紀最具竟爭性和挑戰性的檢測分析技術。

?以熒光標記的熒光免疫分析(?fluoresceneimmunoassay?,?FIA?)?是由Conn等首創于20世紀40年代的一種標記免疫學技術，以熒光素、熒光染料、量子點、鑭系元素等為標記物，將抗原或抗體標記以熒光物質再與相應的抗原或抗體結合，在熒光顯微鏡等相應檢測系統下，檢測熒光強度和熒光現象的一種檢測方法。該法具有靈敏度高、特異性強的特點，但某些熒光素會產生生物學毒性，導致抗原或抗體的靈敏度和選擇性下降。近期研究較熱的FIA主要包括時間分辨免疫分析法(Time-resolved?fluoroimmunoassay,?TRFIA)、量子點熒光免疫分析法(Quantum?dots?immunoassay,?QIA)、熒光偏振免疫分析法(fluorescence?polarization?immunoassay，FPIA)。?

TRFIA是以鑭系元素如銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(Sm)、鈮(Nd)等長壽命的熒光物質標記抗體，在壽命很短的生物材料背景熒光完全衰減后再進行檢測，從而獲得稀土離子的特異熒光信號，實現分析方法靈敏度的突破。有研究已將稀土元素引入測流免疫層析試紙，提高試紙的靈敏度。半導體量子點納米晶，簡稱量子點?(quantum?dots，QDs)，具有激發譜寬，發射譜窄、熒光性強、不易淬滅、顏色可調等優點，是目前認為最具潛力的熒光探針。量子點在生命科學領域的應用還需要大量更為細致的工作，要求重復性好、可信性高，而且要求操作更為簡潔方便。FPIA是一種利用反應分子在反應體系中的旋轉速度與分子大小呈反比的特點而對熒光標記抗原進行檢測的技術。該法均相測量方案易于快速進行、熒光標記物質半衰期長、結果準確等。但是由于FPIA是針對相對分子質量的大小進行測量的，對本身分子很大的物質不適合采用此方法。?

膠體金免疫技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種的免疫分析技術。它主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大景聚焦時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測。該法不需要加入發色試劑，標記物穩定，實驗結果可以長期保存而不腿色，具有簡單、快速、準確和無污染等優點，在醫學、動植物檢疫、食品安全監督各領域得到了日益廣泛的應用。但在實際應用過程中也存在著一些問題，如膠體溶液的穩定性較差、存放時間相對較短及靈敏度受到多種因素的影響而下降等，導致該技術的應用受到一定限制。?

三、發明內容：

本發明的目的：提供一種與常規固相免疫分析法相比，更簡便、更快速;與常規膠體金免疫層析檢測方法相比，更靈敏，適于定量的新型免疫層析檢測方法。本發明的另一目的是提供了一種用磷光二氧化硅納米顆粒標記物制作的免疫層析檢測試紙條。

本發明的技術方案是：?

本發明所說的用磷光二氧化硅納米顆粒制作的快速檢測試紙條方法的實施步驟如下:

?1)將捕捉抗體或抗原直接或間接固定在層析膜上:將捕捉抗原或抗體通過物理吸附方式直接固定在層析膜上，對不能直接固定在層析膜上的分子量較小的抗原，通過預先將小分子抗原與載體蛋白交聯，再通過物理吸附的方式固定于層析膜上;

?2)免疫層析:在層析膜一側的樣品墊上加入樣品液和標記抗體，發生的免疫反應經過層析形成免疫復合物帶，所說的標記抗體指的是用磷光二氧化硅納米顆粒標記的與待測抗原特異結合的單克隆或多克隆抗體，所說的免疫復合物帶包括檢測帶和控制帶;