[發明專利]一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法

有效

• 申請號: 201210529390.2
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN103014037A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 畢玉平;陳高;何慶芳;張燕;李偉智;邊斐;范仲學;單雷;彭振英;馬德源
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院高新技術研究中心
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明涉及一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，屬于植物基因工程技術領域。?

背景技術

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated?fatty?acids，PUFAs)是指含有兩個以上雙鍵且碳原子數為16-22的直鏈脂肪酸。是構成高等動、植物細胞的重要成分之一，對人體具有重要的生理功能。在營養學和醫學領域有著重要作用。目前市場上的多不飽和脂肪酸的主要來源是深海魚類，但從魚體內提取的PUFA具有較重的魚腥味，且魚油資源有限，價格昂貴，存在潛在的污染問題及因過度捕殺致使全球魚類數量下降，影響海洋生物的多樣化并造成沿岸生態系統的破壞，進而影響生態可持續發展。?

藍藻(cyanobacteria)是一類能進行光合作用的原核生物，藍藻細胞可以利用簡單的無機物合成有機物，所表達的外源基因產物不形成包含體，并且多數藍藻及其提取物對人畜無毒，是轉基因研究的良好受體。集胞藻PCC?6803(Synechocystis?sp.strain?PCC6803)做為一種單細胞藍藻，具有生長速度快、培養條件簡單、不產生毒素、細胞結構簡單、遺傳背景清楚、方便分子操作等特點，適合于利用廣核生物反應器大規模生產，是很好的藍藻基因工程受體。野生型集胞藻PCC?6803中亞油酸（LA）占54.5%，γ-亞麻酸（GLA）占27.3%，這為通過轉化外源脂肪酸脫飽和酶基因進而增加集胞藻PCC?6803中多不飽和脂肪酸含量的研究提供了基礎。?

植物中脂酰-酰基載體蛋白硫脂酶（Acyl-Acyl?Carrier?Protein?thioesterases,FAT）是游離脂肪酸合成的關鍵酶，能催化Acyl-ACPs脫去ACP，產生游離脂肪酸。對于植物脂肪酸的鏈長和飽和性有重要作用。植物Fat按其序列高同源性和底物偏好主要分為FatA和FatB1兩個基因家族，不同FAT對底物的選擇不同，這種底物的特異性直接導致了植物油脂儲存在組成上和數量上的差異。其中FatA基因家族的酶主要對油酰-ACP（18:1-ACP）有活性，決定著植物體內18:1輸出到質體外的水平。在大多數植物中，FatB1基因家族主要傾向于生成飽和的acyl-ACP脂酰碳鏈，如對棕桐酰-ACP(16:0-ACP)、硬脂酰-ACP(18:0-ACP)有活性，單非飽和的油酰-ACP(18:l-ACP)也有少量的活性。?

目前已從向日葵（Helianthus?annuus）、油菜（Brassica?napus）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、蓖麻（Ricinus?communis）、山竹（Garcinia?mangsotana）、小麥（Triticum?aestivum）、葡萄（Vitis?vinifera）等多種植物中獲得FatA基因片段。FatB1基因也已在在加利福尼亞月桂樹（Umbellularia?californica）、萼苣花（Cuphea?hookeriana）、油菜（Brassica?napus）、擬南芥（Arabidopsis?thaliana）、山竹（Garcinia?mangostana）、玉米（Zea?mays）、毛白楊（Populustomentosa）等植物種子中獲得，但國內外在目前的現有技術中對硫脂酶基因的研究很少，在花生中雖有硫脂酶基因的克隆，但是還沒有硫脂酶基因功能研究的報道。?

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。?

本發明的技術方案如下：?

一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下：?

（1）PCR擴增集胞藻PCC?6803的psbA2啟動子基因片段、集胞藻PCC?6803的psbA2ORF基因片段、Genbank登錄號為GU324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登錄號為GU324447的花生硫脂酶基因AhFatB1；?

（2）將步驟（1）獲得的psbA2啟動子基因片段分別與步驟（1）制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1進行融合PCR擴增，分別制得基因片段Promotor+AhFatA和基因片段Promotor+AhFatB1；?

（3）將步驟（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1經融合PCR擴增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1；?