[發明專利]大豆內生細菌多樣性的PCR-DGGE分析方法

無效

• 申請號: 201210519961.4
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN102943117A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 孟利強;趙曉宇;李晶;張淑梅;曹旭;姜威;張云湖
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 王艷萍

技術領域

本發明涉及一種大豆內生細菌多樣性的分析方法。

背景技術

植物內生細菌是植物微生態系統中的天然組成成分，人們發現健康植物體內存在細菌，并且已經認識到植物內生細菌具有促進宿主或周圍其他植物的生長、增強宿主植物的抗性等作用。隨著越來越多的細菌從不同植物體內分離到，有關內生細菌的研究才逐漸引起人們的廣泛關注。植物內生細菌作為生防因子在預防植物病蟲害方面具有廣泛的應用前景，它們不僅能夠減輕和防治植物病害，而且能夠減少因使用化學農藥帶來的環境污染等問題。

人們對植物內生細菌的研究多數采用傳統培養方法，對其生物學功能進行研究。但是，由于人們對內生細菌的生長條件尚不清楚，所用分離培養基不能滿足所有內生細菌的營養需求，僅有很少一部分內生細菌能夠被分離到。因此，傳統培養方法不能全面客觀的反映植物內生細菌的種群結構、細菌多樣性等信息。

發明內容

本發明是要解決傳統培養方法不能全面、準確反映大豆內生細菌的種群結構、細菌多樣性的問題，提供大豆內生細菌多樣性的PCR-DGGE分析方法。

本發明大豆內生細菌多樣性的PCR-DGGE分析方法，按以下步驟進行：

一、大豆根表面的清理及滅菌；

二、采用CTAB法提取滅菌后的大豆根的總DNA；

三、大豆根總DNA的純化；

四、以純化后的大豆根總DNA為模板，以799F和1492R為引物，進行第一次PCR擴增，將第一次PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC堿基的片段，然后以產物A為模板，采用添加了GC堿基片段的引物968F和1378R為引物，進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物B；

六、使用變性梯度凝膠電泳裝置進行垂直電泳，先將電泳緩沖液預熱至60℃，以180V電壓預電泳10min，然后向DGGE膠的加樣孔中加入200μL產物B，在180V電壓下，電泳3h，最終確定變性劑濃度梯度為30％～70％；

七、使用變性梯度凝膠電泳裝置進行水平電泳，選擇變性劑濃度梯度為30％～70％，先將電泳緩沖液預熱至60℃，以180V電壓預電泳10min，然后向每個加樣孔加入10μL產物B，在180V電壓下，電泳6h，電泳結束后對DGGE膠進行染色，拍照，即完成大豆內生細菌多樣性的PCR-DGGE分析方法；其中步驟四中第一次PCR擴增所用引物799F序列為5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R??序列為5’-GGTTACCTTGTTACGACTT??-3’；步驟五中引物968F??序列為5’-AACGCGAAGAACCTTAC??-3’，引物1378R??序列為5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的堿基片段為CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

本發明的有益效果：

本發明方法能全面、準確反映大豆內生細菌的種群結構、細菌多樣性。與傳統的培養方法相比該方法具有操作簡便、快速、重復性好等優勢，在24小時內即可獲得結果，在快速同時還能對比分析大量樣品，因此它可以對比分析大豆不同組織部位的內生細菌群落的差異，也可以研究同一部位的不同生長時期的變化過程。

此外，該方法可以對膠片中的單一條帶進行分析：直接從膠中回收DNA，然后構建其克隆文庫，再對其中的克隆進行測序，分析種屬多樣性等。

附圖說明

圖1為具體實施方式五步驟二中提取的大豆根的總DNA的電泳圖；圖2為具體實施方式五步驟四獲得的產物A的電泳圖；圖3為具體實施方式五步驟五獲得的產物B的電泳圖；圖4為具體實施方式五步驟六中垂直電泳；圖5為具體實施方式五步驟七中水平電泳圖。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式大豆內生細菌多樣性的PCR-DGGE分析方法，按以下步驟進行：

一、大豆根表面的清理及滅菌；

二、采用CTAB法提取滅菌后的大豆根的總DNA；

三、大豆根總DNA的純化；