[發明專利]文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因及其編碼蛋白和應用

有效

• 申請號: 201210517841.0
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103849624A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 王鴻霞;郇聘;岳欣;劉保忠
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N5/07;C12N5/071;C07K14/435
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體的說是一種文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因及其編碼蛋白和應用。

背景技術

DNA結合抑制因子是一類在生物發育過程中廣泛表達的轉錄調控因子,屬于螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix,HLH)轉錄因子家族成員之一，對堿性HLH(bHLH)轉錄因子活性起負調節作用。bHLH轉錄因子是一群廣泛分布或具有組織特異性的，以同二聚體或異二聚體形式和DNA結合的蛋白質組成的一個大家族，能活化與細胞分化有關的基因轉錄。但作為HLH家族成員的ID分子，由于缺乏DNA結合域，與一些轉錄因子(主要是bHLH蛋白)形成非活性異二聚體，可抑制bHLH與DNA上的E基序結合或與其他組織特異性bHLH轉錄因子結合，從而負向調控細胞分化。自1990年在哺乳類動物中發現ID分子以來，有關該分子在哺乳細胞增殖、分化、腫瘤發生等方面進行了廣泛而深入的研究。然而關于ID基因在無脊椎動物中的研究還鮮有報道。到目前為止，沒有從文蛤中獲得ID基因的報道。

貝類組織培養工作從20世紀60年代末期開始,國內從20世紀80年代才開始進行該領域的研究。但是就目前的情況看,貝類的組織培養還未取得突破性的進展,至今還未有成功建立貝類細胞系的報道。培養基中合適的生長添加因子的缺乏，無法為細胞提供一個類似生物體內的生長環境，無疑是影響貝類細胞系成功建立的關鍵因素之一。

發明內容

本發明的目的是提供一種文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因及其編碼蛋白和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因，文蛤mmID2基因的cDNA序列為序列表SEQ?ID?No.1中所示的核苷酸序列所示。

文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因的編碼蛋白，所述文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因的cDNA序列所編碼的蛋白為序列表SEQ?ID?NO?2中所示的氨基酸序列。

文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因的應用，所述序列表SEQ?ID?No.1中所示的文蛤mmID2基因的重組表達產物可作為細胞增殖的生長添加因子。

文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因的應用，所述序列表SEQ?ID?No.1中所示的文蛤mmID2基因的重組表達產物可作為細胞分化抑制劑。

本發明所具有的優點：本發明利用表達序列標簽技術（EST）,從文蛤中克隆到mmID2基因cDNA全長序列，通過PCR技術擴增編碼mmID2蛋白的基因片段并將其克隆到pET30a(+)表達載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)-plysS實現體外重組表達。重組蛋白經HisTrap?HP親和柱純化后得到具有活性的純化蛋白。經檢測此重組蛋白具有明顯的促進細胞增殖，抑制細胞分化的作用，可以應用于細胞培養作為促進細胞增殖蛋白使用；將本發明文蛤mmID2重組蛋白具作為促進貝類細胞增殖的生長因子添加到培養基中，可以為貝類等無脊椎動物細胞培養研究帶來新的契機。并且該重組蛋白具有規模化生產的可能，可以彌補天然蛋白量低以致難以滿足需要的局限。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的純化的文蛤mmID2重組蛋白，其中從左到右分別為M蛋白marker，1為純化的重組蛋白）。

圖2為本發明實施例提供的所獲得文蛤mmID2重組蛋白抑制分化，促進C2C12細胞增殖效果圖。

圖3為本發明實施例提供的空白對照組C2C12細胞形態改變發生分化效果圖。

具體實施方式

下面的實施例中將本發明作進一步闡述，但本發明不限于此。

實施例1.

一種克隆得到的文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因，具有SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列。

本發明中的文蛤DNA結合抑制因子mmID2基因的cDNA序列克隆包括下列步驟：

a)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；

b)文蛤cDNA文庫構建；

c)文蛤cDNA文庫EST序列的大規模測定；

d)文蛤EST序列的同源性分析及mmID2基因片段的篩選；

e)RACE擴增獲得的mmID2全序列以及全序列的驗證。

序列表SEQ?ID?No.1為：