[發明專利]一種產生膠原蛋白酶的菌株及其應用

有效

• 申請號: 201210517035.3
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103045503A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 錢斯日古楞;王紅英
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12P21/06;C12R1/425
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

1.一種產膠原蛋白酶的菌株，該菌株為嗜蟲沙雷氏菌（Serratiaentomophila）DLW-22，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC?No.6488。

2.如權利要求1所述的菌株DLW-22在水解膠原蛋白中的應用。

3.利用權利要求1所述的菌株DLW-22制備膠原蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）將菌株DLW-22接種至種子培養基中，30～45℃、培養5～12h；

（2）將步驟（1）的菌培養液接入發酵培養基中，30～45℃、培養12～48h；

（3）將步驟（2）的發酵培養液經離心，上清液在硫酸銨飽和溶液中沉淀，沉淀經冷凍干燥后，即得膠原蛋白酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述種子培養基包括如下成分：每升蒸餾水中含有酵母膏10g，蛋白胨10g，NaCl?5g，pH為6.5～9.5；發酵培養基包括如下成分：每升蒸餾水中含有葡萄糖20g，酵母膏1.5g，蛋白胨10g，CaC1₂0.05g，NaH₂PO₄.2H₂O?0.5g，K₂HPO₄.3H₂O?2.5g，pH為6.5～9.5。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于在步驟（2）所述菌培養液和發酵培養基的體積比為1:10～20。

6.權利要求1所述的菌株DLW-22的分離、篩選方法，其特征在于包括如下步驟：

①海參腸道混合菌液的制備：用無菌水將海參活體洗凈，取部分腸段或全腸，混合于無菌水中，震蕩，離心后吸取上清液，接種于5～15倍體積基礎培養基中富集培養，在25～45℃，搖瓶培養24～48h，獲得海參腸道菌混合液；

其中所述的基礎培養基：每升蒸餾水中含有酵母膏5g，NaCl?10g,蛋白胨10g,pH為自然；

②初篩：將步驟①制備的海參腸道菌混合液，梯度稀釋后涂布于初篩培養基平板上，25～45℃倒置培養至形成單菌落，觀察并選取具有透明圈的單菌落，轉至另一初篩培養基平板上，30～40℃培養24～48h，在菌落周圍滴加酸性汞試劑，觀察透明圈形成情況；

其中所述的初篩培養基：每升蒸餾水中明膠20g，葡萄糖30g，蛋白胨5g，KH₂PO₄?0.5g，MgSO₄.7H₂O?0.2g，NaCl?0.1g，pH為自然；所述的酸性汞試劑：HgCl₂?15g，濃鹽酸20g，溶于蒸餾水，定容至100mL。

③復篩：挑取滴加酸性汞試劑時有明顯透明圈的菌落，接種于種子培養基中，搖瓶培養12～24h；接種至發酵培養基中，25～45℃搖瓶培養24～48h，得到菌培養液；

其中所述的種子培養基：每升蒸餾水中含有酵母膏10g，蛋白胨10g，NaCl?5g，pH為6.5～9.5；發酵培養基：每升蒸餾水中含有葡萄糖20g，酵母膏1.5g，蛋白胨10g，CaC1₂?0.05g，NaH₂PO₄.2H₂O?0.5g，K₂HPO₄.3H₂O?2.5g，pH為6.5～9.5；

④對步驟③得到的菌培養液進行活菌數的測定,并對其離心后的上清液進行膠原蛋白酶酶活力測定，篩選出一株活菌數和膠原蛋白酶活力良好的菌株，命名為DLW-22。