[發明專利]紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法

無效

• 申請號: 201210513000.2
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN103063758A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 姜華;何承剛;畢玉芬;單貴蓮;馬向麗;辛培堯
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 馬曉青

技術領域：

本發明屬于植物生化檢測技術領域，具體地，涉及一種紫花苜蓿(Medicago?sativa?L.)葉黃素循環組分的快速檢測方法。

背景技術：

紫花苜蓿(Medicago?sativa?L.)是我國栽培歷史最久、分布最廣、種植最多的優良豆科牧草。紫花苜蓿具有產量高、品質好、蛋白質含量高、適口性好等特點，被譽為“牧草之王”。同時，它能保持水土、培肥地力、增加飼料，對改善農牧業生態環境、促進畜牧業發展有重要作用。由于種植條件粗放，紫花苜蓿經常受到強光、干旱和土壤貧瘠等逆境的脅迫而發生光抑制甚至光破壞，使其光合效率降低、品質下降。環境脅迫如高溫、干旱、強光和貧瘠等條件下，植物的光合能力下降，積累的過剩光能易導致光破壞，依賴于植物體內的葉黃素循環耗散過剩激發能，是光合器官在自然條件下免遭光破壞的重要途徑之一。葉黃素循環組分由玉米黃質（Z）、環氧玉米黃質（A）和紫黃質（V）構成。當光合器官吸收的光能不能全部被光合作用利用時，V在紫黃素脫環氧化酶催化下。經中間體A脫環氧生成Z，在沒有過剩光能條件下，Z在環氧化酶催化下經中間體A加環氧生成V。且Z隨著過剩光能的增加而增加，并直接參與熱耗散而將多余的激發能猝滅，起到光保護作用。因此，建立紫花苜蓿葉黃素循環組分的測定方法是十分必要的。目前對植物葉黃素循環組分的測定大多數采用的是Spherisorb?C₁₈色譜柱柱，使用的流動相是Tris-HCL緩沖液、甲醇和乙酸乙酯。該流動相要么形成不溶于水的晶體沉淀而堵塞管路系統，導致柱壓急劇升高，大大縮短了柱的有效使用壽命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要經常洗脫，不僅費時費力，且經常使得被測組分的峰形被破壞。所以建立對色譜柱無傷害、靈敏準確的紫花苜蓿葉黃素組分循環測定方法具有十分重要的作用。

發明目的：

針對現有技術存在的上述不足，本發明旨在提供一種紫花苜蓿葉黃素循環組分的快速檢測技術，采用價格較Spherisorb?C₁₈相對便宜的Hypersil?ODS色譜柱，采用對色譜柱無傷害的常用試劑乙腈作為流動相，為紫花苜蓿葉黃素循環組分的快速、準確檢測提供了節約人力、物力和財力的方法。從色素的提取到檢測全過程只需1小時即可完成，該方法快速、靈敏、準確。

本發明的上述目的是通過下述的技術方案加以實現的：

紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，取紫花苜蓿鮮葉0.1g,倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3?min，再加入100%丙酮，勻漿1?min之后置于冰上15?min，1200g離心10?min，取上清液用0.45?μm微孔濾膜過濾后進樣到高效液相色譜儀采用濃度線性梯度洗脫，從而檢測紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質（Z）、環氧玉米黃質（A）和紫黃質（V）的含量。

所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述高效液相色譜儀使用美國Agilent?1100高效液相色譜儀，色譜柱使用美國Agilent?Hypersil?ODS的4.0×250?mm，5?μm色譜柱。

所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述濃度線性梯度洗脫，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序為90%?A液?+?10%?B液洗脫15min，接著在5min內，90%?A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20?min，流速1?ml/min，檢測波長445?nm，柱子溫度30℃，進樣體積10?μl。

所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，所述紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質0119、環氧玉米黃質0231和紫黃質0259標樣購自瑞士carotenature原裝，純度分別為99.6%、95.7%和98.6%。

所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述紫花苜蓿葉黃素提取過程在無光條件下進行。

所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述試劑丙酮為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。