[發明專利]大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞的提取方法和專用培養基無效

申請號：	201210512416.2	申請日：	2012-12-04
公開（公告）號：	CN103184191A	公開（公告）日：	2013-07-03
發明（設計）人：	胡飛虎;孫博;肖忠黨	申請（專利權）人：	東南大學
主分類號：	C12N5/0775	分類號：	C12N5/0775
代理公司：	南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204	代理人：	柏尚春
地址：	211189 江蘇***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	大鼠網膜脂肪來源間充質干細胞提取方法專用培養基
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞的提取方法和專用培養基。

背景技術

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells，MSCs）是一種來源于中胚層和外胚層的多潛能干細胞，按照發育過程分類屬于成體干細胞。間充質干細胞和胚胎干細胞一樣具有自我更新的能力，同時并具有向多個胚層分化潛能，在特定誘導條件下能分化為骨、軟骨、脂肪、神經、肝細胞等多種組織細胞。間充質干細胞存在于多種組織中，目前已經從骨髓、脂肪、肌肉等組織中成功獲得了間充質干細胞。2001年，祖克（Zuk）從病人抽脂手術中的脂肪液中提取了一種具有自我更新和分化的間充質干細胞，這類干細胞被命名為脂肪來源的間充質干細胞（adipose-derived?mesenchymal?stem?cells，ADSCs）。脂肪來源間充質干細胞具有以下特點：（1）增殖能力強：體外培養第5代后可擴增100倍，且無明顯衰老跡象。（2）免疫原性低：脂肪來源間充質干細胞在用于干細胞移植時，由于自體脂肪組織含量較高，所以多用于自體移植，所以其具有較低的免疫原性。（3）致腫瘤風險低：脂肪來源間充質干細胞具有穩定的端粒酶活性，在維持其增殖性的同時不具有致腫瘤性。近年來研究表明，ADSC細胞由于脂肪組織具有取材方便和干細胞含量較高等優勢，同時在分化性能上，和骨髓來源的間充質干細胞基本相同，因此在干細胞進行受損的組織或器官的修復上具有廣闊的應用前景。

但是在脂肪來源間充質干細胞在從實驗室走上臨床應用，要面臨干細胞的來源的不同會導致其自我更新以及分化能力的不同，因此尋找和對比多種脂肪來源可以豐富脂肪干細胞的組織來源。

發明內容

技術問題：鑒于現有的動物體內多個部位具有脂肪組織，因此本發明提出了一種從大鼠大網膜脂肪提取間充質干細胞的方法，同時提供一種能提取和長期維持大鼠大網膜脂肪來源帶間充質干細胞活性的提取和培養液。使用本發明提取和培養的大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞在傳至10代后仍能維持干細胞的活性，保持干細胞的較高的增殖能力和多個胚層方向分化潛能。

技術方案：為解決上述技術問題，本發明公開了一種大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞的提取方法，該方法包括如下步驟：

步驟1：無菌條件下取健康斯潑累格·多雷(SD)大鼠的大網膜脂肪，剪碎成1-3mm³的小塊；

步驟2：用冰磷酸鹽緩沖液混合后離心，去除部分脂肪組織；

步驟3：I型和II混合膠原酶消化離心，去除上部脂肪細胞組織；

步驟4：再次離心后用加入含有特定生長因子的培養基重懸后移入培養瓶中；

步驟5：培養瓶放入培養箱中持續傳代培養。

優選的，步驟1中，剪碎至1-3mm³。

優選的，步驟2中，用4℃的磷酸鹽緩沖液混合剪碎的脂肪組織后低速離心。

優選的，步驟3中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶比例為1：1，混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分數比為1：1000，每克脂肪組織使用3ml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，水浴消化時間為1小時，消化時水浴溫度為37℃。

本發明還提供了一種用于大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞的培養基：該培養基包括低糖達爾伯克氏改良伊格爾培養基、胎牛血清、胰島素、大鼠重組成纖維生長因子、大鼠表皮生長因子、甲狀腺原氨酸。

優選的，基礎培養基為低糖達爾伯克氏改良伊格爾的培養基百分比位94%、，添加胎牛血清的體積百分比為5%、抗生素體積百分比為1%、胰島素10ug/ml、大鼠重組成纖維生長因子5ng/ml、大鼠表皮生長因子5ng/ml、甲狀腺原氨酸10ng/ml。

有益效果：本發明提供的提取和培養方法能快速獲得大鼠大網膜脂肪來源間充質干細胞，并且能長時間維持干細胞的增殖和分化能力，在傳代至第10代后獲得的細胞仍然具有干細胞活性。